許穎，嚴(yán)常燕，楊偉聰，張?jiān)茣?，于洋，黃顯會(huì)

金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)的比較藥動(dòng)學(xué)研究

許穎，嚴(yán)常燕，楊偉聰，張?jiān)茣?，于洋，黃顯會(huì)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

【目的】采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）建立了金霉素在豬血漿中的藥動(dòng)學(xué)檢測(cè)方法，以三元健康雜交豬為對(duì)象，研究了10%和15%金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，為金霉素的臨床應(yīng)用提供依據(jù)?！痉椒ā?6頭大長(zhǎng)白三元雜交豬，體重(20±2.5)kg，隨機(jī)分為禁食組和非禁食組2組，采用三藥劑三周期三交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別按10 mg·kg-1b.w.靜注鹽酸金霉素溶液、40 mg·kg-1b.w.灌服10%和15%金霉素微囊顆粒。每次給藥間隔為7 d，根據(jù)試驗(yàn)前設(shè)定好的時(shí)間點(diǎn)采集血樣，分離血漿，進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定，血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用WinNonlin5.2.1軟件非房室模型處理，計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。血漿樣品用0.1 mol·L-1Na2EDTA-McIlvaine緩沖液超聲提取，HLB固相萃取柱凈化，35℃水浴吹干后用甲醇定容，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析測(cè)定。色譜柱為CNW C18柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫，流速為0.25 mL·min-1；電噴霧離子源，多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式，外標(biāo)法定量。豬血漿中金霉素的檢測(cè)限為5 ng·mL-1，定量限為10 ng·mL-1，在5—500 ng·mL-1范圍內(nèi)，方法的線性關(guān)系良好，低、中、高三個(gè)添加水平下，金霉素的平均回收率為76.90%—89.25%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為2.97%—9.45%、6.16%—13.39%。該方法準(zhǔn)確、靈敏，適用于金霉素在豬血漿中的測(cè)定?！窘Y(jié)果】禁食組靜注鹽酸金霉素溶液主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：AUC0-∞為（57.42±23.53）mg·h·mL-1，V/F為（5.67±2.12） L·kg-1，MRT為（13.87±2.00）h，t1/2為（19.93±5.26）h；分別灌服10%金霉素微囊顆粒和15%金霉素微囊顆粒后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：AUC0-∞分別為（34.46±10.28 ）mg·h·mL-1和（33.15±12.76）mg·h·mL-1，Cmax分別為（2.48±1.05）mg·mL-1和（2.97±1.88 ）mg·mL-1，Tmax分別為（4.88±1.25）h和（3.13±1.55）h，V/F分別為（31.53±15.98）L·kg-1和（32.30±9.69）L·kg-1，MRT分別為（19.93±3.83）h和（17.41±1.80）h，t1/2分別為（16.87±3.49）h和（17.13±3.58）h，F(xiàn)分別為（17.03±0.08）%和（15.82±5.16）%。非禁食組靜注鹽酸金霉素后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：AUC0-∞為（37.58±21.30）mg·h·mL-1，V/F為（12.59±6.43） L·kg-1，MRT為（22.17±14.47）h，t1/2為（27.79±12.82）h；分別灌服10%金霉素微囊顆粒和15%金霉素微囊顆粒后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：AUC0-∞分別為（20.81±7.46）mg·h·mL-1和（19.72±5.69）mg·h·mL-1，Cmax分別為（1.02±0.38）mg·mL-1和（0.95±0.32）mg·mL-1，Tmax分別為（6.38±4.44）h和（8.00±5.24 ）h，V/F分別為（52.40±22.90） L·kg-1和（52.47±19.69） L·kg-1，MRT分別為（24.67±9.52）h和（23.37±4.21）h，t1/2分別為（18.57±10.67）h和（16.64±5.12）h，F(xiàn)分別為（16.07±6.78）%和（15.26±5.26）%?！窘Y(jié)論】灌服10%金霉素微囊顆粒（40 mg·mL-1b.w.）及15%金霉素微囊顆粒（40 mg·mL-1b.w.）后，藥物在豬體內(nèi)吸收緩慢，分布廣，消除較慢，生物利用度低。與禁食組相比，非禁食組10%和15%金霉素微囊顆粒達(dá)峰時(shí)間更慢、峰濃度更低，但表觀分布容積更大，生物利用度偏低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著。表明飼料不影響金霉素在豬胃腸道中的吸收，但會(huì)改變金霉素進(jìn)入體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

金霉素；藥物動(dòng)力學(xué)；HPLC-MS/MS；豬

0 引言

【研究意義】金霉素(chlortetracycline，CTC)，又稱氯西霉素，是由美國(guó)氰胺公司于1949年開(kāi)發(fā)的四環(huán)素類廣譜抗生素，它通過(guò)與細(xì)菌核糖體30s亞基不可逆的結(jié)合抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌、支原體和立克次體等有廣泛的抑制作用，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)被廣泛用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[1-4]。【前人研究進(jìn)展】金霉素被FDA批準(zhǔn)用于雞、豬、牛、羊等動(dòng)物多種疾病的預(yù)防與治療，國(guó)內(nèi)主要用于治療斷奶仔豬腹瀉、豬氣喘病、增生性腸炎等。對(duì)于增生性腸炎、豬痢疾等仔豬腹瀉性疾病，金霉素有很好的治療效果，它可以影響腸道炎癥因子的表達(dá)，改善斷奶仔豬腸道黏膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，降低腹瀉率，相比于泰妙菌素和林可霉素，金霉素的使用成本更低[5-6]。金霉素能夠有效減輕豬肺炎支原體感染引起的損傷，治療支原體肺炎[7- 8]，改善呼吸道癥狀，降低病變[9]，在飼料中定期添加金霉素還可以控制衣原體和鉤端螺旋體感染，改善母豬的健康狀況，提高種豬的繁殖性能[10-12]。金霉素雖在豬、雞、牛、羊等動(dòng)物上已有相關(guān)藥動(dòng)學(xué)報(bào)道[13-20]，但劑型多為鹽酸金霉素和普通的金霉素預(yù)混劑。研究表明，鹽酸金霉素或普通金霉素預(yù)混劑給藥后吸收迅速，達(dá)峰時(shí)間短，分布廣泛而且消除緩慢，生物利用度低，但在不同動(dòng)物種屬之間有較大的差異。目前，隨著獸藥制劑技術(shù)的發(fā)展，微囊化制劑由于掩味、能夠減少胃酸對(duì)藥物的破壞、腸溶緩釋等優(yōu)點(diǎn)[21-22]，在獸醫(yī)臨床使用越來(lái)越普遍。金霉素微囊化后，能夠減少藥物與飼料中其他物質(zhì)的接觸、減少在胃液中崩解、釋放，還能夠調(diào)節(jié)在腸道內(nèi)的釋藥速度，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究探討了金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，比較了禁食與非禁食對(duì)金霉素生物利用度的影響，為金霉素微囊顆粒臨床使用制定合理的給藥方案提供依據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究旨在通過(guò)靜脈注射和灌胃口服的給藥方式，探討金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)的比較藥動(dòng)學(xué)，通過(guò)相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的比較，為金霉素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 鹽酸金霉素對(duì)照品，含量92.1%，批號(hào)K0011209，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；鹽酸金霉素原料藥，含量93.2%，批號(hào)H20130112，10%金霉素微囊顆粒，規(guī)格100 g：10 g，批號(hào)WN20130702，15%金霉素微囊顆粒：規(guī)格100 g：15 g，批號(hào)WN20130703，均由金河生物科技股份有限公司提供。乙腈、甲醇、甲酸為HPLC級(jí)，德國(guó)CNW公司；氫氧化鈉、鹽酸、十二水磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、EDTA二鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純；水為符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

1.1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀：Agilent 1200型液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司，配備四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱等；電噴霧-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀：API 4000 MS/MS，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，配Analyst4.1.5軟件；色譜柱：CNW Athena C18 WP（150 mm×2.1 mm，5 μm)，上海安譜公司；Mach 1.6 R冷凍型離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Milli Q 去離子水發(fā)生器：美國(guó)Millipore 公司；軌道式搖床：HS250，馬來(lái)西亞IKA公司；pH 計(jì)：pHs-25 型，上海精科雷磁儀器廠；電子分析天平：AE 160型，瑞士Mettler公司；移液器：Eppendorf Research型，德國(guó)EPPENDORF公司；氮吹儀：D10-24型，杭州奧盛儀器有限公司；固相萃取小柱：Poly-Sery HLB SPE，60 mg/3mL，德國(guó)CNW科技公司；有機(jī)針式尼龍微孔濾膜，13 mm×0.22mm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 試液配制

0.1%甲酸水溶液：取1.0 mL甲酸，加水稀釋至1 000 mL，混勻，超聲脫氣；

1 mol·L-1氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉4 g，加水溶解并稀釋至100 mL；

McIlvaine緩沖液：將0.1 mol·L-1檸檬酸溶液1 000 mL與0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液652 mL 混合，搖勻即可。必要時(shí)用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)pH至4.0±0.05；

0.1 mol·L-1Na2EDTA-McIlvaine緩沖液：稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉倒入1 625 mL McIlvaine緩沖溶液中，超聲使其溶解，搖勻。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)于2013年6—12月于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院進(jìn)行，試驗(yàn)選取16頭健康的杜洛克×長(zhǎng)白×約克夏雜交豬，公母各半，7周齡左右，（20±2.5）kg，按常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和采食，飼料為全價(jià)日糧，不含抗菌藥物。試驗(yàn)前觀察1周，臨床表現(xiàn)健康。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 給藥 16頭健康豬隨機(jī)分為2組，A組為非禁食組，B組為禁食組，每組8頭。臨床觀察健康后，采用自身對(duì)照隨機(jī)三藥劑、三周期、三交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，將每組的8頭豬隨機(jī)編號(hào)，給藥方案見(jiàn)表1。A組在給藥0.5 h前正常飼喂，B組試驗(yàn)前16 h起及給藥后3 h期間禁食，僅自由飲水。一個(gè)藥動(dòng)采血周期結(jié)束，經(jīng)過(guò)7 d的清洗期后，給藥制劑互換。試驗(yàn)豬只采用單劑量給藥，靜脈注射和灌胃口服給藥劑量分別為10 mg·kg-1b.w.和40 mg·kg-1b.w.（以金霉素計(jì)）。

表1 金霉素制劑給藥方案

1.2.2 樣品采集 豬只仰臥保定，從前腔靜脈采血。給藥前采一次空白血。給藥后分別于5、10、15、20、30、45 min及1、1.5、2、3、4、6、8、12、16、24、36、48、72 h采集血樣。每次采血3 mL左右，置于含肝素的離心管中，4 000 r/min離心10 min，分離血漿，-20℃冰箱保存，待測(cè)。

1.2.3 血漿中金霉素測(cè)定

（1）樣品前處理 血漿樣品自然解凍后搖勻，準(zhǔn)確吸取0.5 mL血漿于15 mL塑料離心管中，加入5 mL EDTA-McIlvaine緩沖液，旋渦混勻1 min，水浴超聲10 min，搖床振蕩10 min后，于4℃下8 000 r/min離心10 min，上清液待凈化。

分別用3 mL甲醇和純水活化HLB SPE小柱，上清液過(guò)柱，自然流速。上清液流出后，3 mL純水淋洗，負(fù)壓抽干后用（2+2）mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于35℃水浴下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)? mL甲醇溶解，轉(zhuǎn)至2 mL離心管，于4℃下12 000 r/min離心10 min，上清過(guò)0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測(cè)定。

（2）液相色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18 WP（150 mm×2.1 mm，5 μm），上海安譜公司；

流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序見(jiàn)表2：

流速：0.25 mL·min-1；

柱溫：35℃；

進(jìn)樣量：5 μL。

表2 液相色譜梯度洗脫條件

（3）質(zhì)譜條件 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式；電噴霧離子源（ESI）：正離子掃描；噴霧電壓（ionspray voltage，IS）：4 000.0 V；離子源溫度：700.0℃；氣簾氣壓力（curtain gas，CUR）15 psi；霧化氣壓力（nebulizer gas，GS1）55 psi；輔助氣流速（ion source gas2，GS2）35 L·min-1；碰撞室壓力（CAD）6 psi；定量離子m/z= 444.1，輔助定性離子m/z= 154.2。

1.2.4 檢測(cè)限與定量限 以最低檢出濃度計(jì)算，信噪比S/N≥3 為檢測(cè)限（LOD），S/N≥10為定量限（LOQ）。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 空白豬血漿按照1.2.3中“（1）樣品前處理”方法進(jìn)行處理。洗脫液在氮吹濃縮后，用1.00 mL相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，其中第一管加入1.00 mL色譜甲醇做空白對(duì)照，其余各管基質(zhì)加標(biāo)樣品濃度分別為5、10、20、50、150、500 ng·mL-1，進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，將金霉素的藥物濃度（C）對(duì)色譜峰面積（A）作線性回歸，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)（）。

1.2.6 回收率與精密度 準(zhǔn)確移取0.49 mL空白豬血漿，分別加入低、中、高不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液0.01 mL，制得10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-13個(gè)濃度水平的空白加標(biāo)樣品，按1.2.3中“（1）樣品前處理”方法處理。每個(gè)濃度做5個(gè)重復(fù)，共做4個(gè)批次，不同批次隔一天或者數(shù)天。同時(shí)，取空白血漿0.5 mL按1.2.3中“（1）樣品前處理”方法處理，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊螅瑲堅(jiān)尤?.00 mL低、中、高3個(gè)濃度的金霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，使得基質(zhì)加標(biāo)樣品的濃度與空白加標(biāo)樣品的上機(jī)濃度一致。將處理后的樣品進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，以測(cè)得的藥物峰面積計(jì)算回收率和批內(nèi)、批間的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.2.7 血藥樣品濃度測(cè)定 給藥后不同時(shí)間采集的血漿，按1.2.3中“（1）樣品前處理”方法處理樣品后進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算血漿中金霉素的濃度。如樣品血藥濃度超出線性范圍，需將樣品用空白基質(zhì)稀釋至線性范圍內(nèi)，然后再進(jìn)行血藥濃度測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 使用Analyst1.5軟件處理實(shí)測(cè)血漿中金霉素濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用美國(guó)Pharsight公司藥動(dòng)學(xué)軟件 Winnonlin5.2.1 的非房室模型來(lái)處理藥動(dòng)數(shù)據(jù)，擬合時(shí)選擇消除相后4—5個(gè)點(diǎn)，計(jì)算出每頭試驗(yàn)豬的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，求出關(guān)鍵藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（F、AUC、Tmax、Cmax等），然后計(jì)算平均值（）及標(biāo)準(zhǔn)差（SD），同時(shí)以血藥濃度平均值對(duì)時(shí)間作藥-時(shí)曲線。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

按照1.2.3中“（1）樣品前處理”方法處理樣品，再按（2）、（3）色譜工作條件進(jìn)行LC-MS/MS分析測(cè)定，測(cè)得豬血漿中金霉素的檢測(cè)限（LOD）為5 ng·mL-1，定量限（LOQ）為10 ng·mL-1，在5—500 ng·mL-1范圍內(nèi)，豬血漿中添加金霉素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.9990以上，金霉素在10、50、100 ng·mL-13個(gè)濃度水平的平均回收率為76.90%—89.25%，批內(nèi)變異系數(shù)為2.97%—9.45%，批間變異系數(shù)為6.16%—13.39%，均滿足獸藥臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究要求。

2.2 金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征

本試驗(yàn)的動(dòng)物分為兩組，禁食組（試驗(yàn)前禁食16 h以上，給藥后禁食3 h）和非禁食組（給藥前0.5 h飼喂，給藥后自由飲食），每組通過(guò)自身對(duì)照隨機(jī)三藥劑、三周期、三交叉方法設(shè)計(jì)，采用非房室模型分析給藥后的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，探索金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)的吸收、分布和消除規(guī)律，通過(guò)藥動(dòng)學(xué)主要參數(shù)的比較分析，從而得知金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)特征。禁食組和非禁食組豬的藥時(shí)曲線分別見(jiàn)圖1、圖2，血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。

禁食組豬靜注鹽酸金霉素溶液（10.0 mg·kg-1）、灌服10%金霉素微囊顆粒（40 mg·kg-1）和15%金霉素微囊顆粒（40 mg·kg-1）后，金霉素靜注給藥后表觀分布容積（V/F）為（5.67±2.12） L·kg-1，消除半衰期（t1/2）為（19.93±5.26） h；灌服10%金霉素微囊顆粒和15%金霉素微囊顆粒后表觀分布容積（V/F）分別為（31.53± 15.98）和（32.30±9.69） L·kg-1，消除半衰期（t1/2）分別為（16.87±3.49）和（17.13±3.58）h，達(dá)峰濃度（Cmax）分別為（2.48±1.05）和（2.97±1.88）mg·mL-1，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）分別為（4.88±1.25）和（3.13±1.55）h，生物利用度（F）分別為（17.03±0.08）%和（15.82±5.16）%。

非禁食組豬靜注鹽酸金霉素溶液（10.0 mg·kg-1）及灌服10%金霉素微囊顆粒（40 mg·kg-1）和15%金霉素微囊顆粒（40 mg·kg-1）后，金霉素靜注給藥后表觀分布容積（V/F）為（12.59±6.43） L·kg-1，消除半衰期（t1/2）為（27.79±12.82）h；灌服10%金霉素微囊顆粒和15%金霉素微囊顆粒后表觀分布容積（V/F）分別為（52.40±22.90）和（52.47±19.69）L·kg-1，消除半衰期（t1/2）分別為（18.57±10.67）和（16.64±5.12）h，達(dá)峰濃度（Cmax）分別為（1.02±0.38）和（0.95±0.32）mg·mL-1，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）分別為（6.38±4.44）和（8.00±5.24）h，生物利用度（F）分別為（16.07±6.78）%和（15.26±5.26）%。禁食組與非禁食組中10%和15%金霉素微囊顆粒吸收、消除均較慢，表觀分布容積較高，在兩組中10%金霉素微囊顆粒在豬體內(nèi)均表現(xiàn)出更高的生物利用度，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）。與禁食組相比，非禁食組10%和15%金霉素微囊顆粒均表現(xiàn)出達(dá)峰時(shí)間更慢，峰濃度更低，但表觀分布容積更大，生物利用度稍低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）。

靜注鹽酸金霉素（10 mg·kg-1 b.w.）、灌服10%和15%金霉素微囊顆粒（40 mg·kg-1 b.w.）

靜注鹽酸金霉素（10 mg·kg-1 b.w.）、灌服10%和15%金霉素微囊顆粒（40 mg·kg-1 b.w.）

表3 禁食組、非禁食組豬單劑量靜注鹽酸金霉素溶液（10.0 mg·kg-1 b.w.）與灌服金霉素微囊顆粒（40.0 mg·kg-1 b.w.）后平均血藥濃度（mg·mL-1, ±SD, n=8）

Table 3 Mean plasma concentrations of ivermectin after receiving single-dose intravenous injection of chlortetracycline hydrochloride (10 mg·kg-1 b.w.) and oral administration of chlortetracycline microspheres (40 mg·kg-1 b.w.) ( mg·mL-1,±SD, n=8)

表3 禁食組、非禁食組豬單劑量靜注鹽酸金霉素溶液（10.0 mg·kg-1 b.w.）與灌服金霉素微囊顆粒（40.0 mg·kg-1 b.w.）后平均血藥濃度（mg·mL-1, ±SD, n=8）

采血時(shí)間Time（h）禁食組Fasting group非禁食組Feeding group 靜注鹽酸金霉素溶液CTC, i.v.灌服10%金霉素微囊顆粒10% CTC Micropheres, p.o.灌服15%金霉素微囊顆粒15% CTC Micropheres, p.o.靜注鹽酸金霉素溶液CTC, i.v.灌服10%金霉素微囊顆粒10% CTC Micropheres, p.o.灌服15%金霉素微囊顆粒15% CTC Micropheres, p.o. 0.08321.96±10.250.05±0.030.08±0.0615.07±9.430.06±0.030.06±0.04 0.16713.60±6.410.09±0.040.22±0.169.12±5.880.08±0.060.09±0.07 0.2511.03±5.020.15±0.090.34±0.276.72±3.650.12±0.070.12±0.09 0.33310.23±4.420.28±0.210.44±0.415.78±2.910.16±0.100.17±0.17 0.58.62±3.670.40±0.320.73±0.564.68±2.220.24±0.120.23±0.20 0.757.84±3.600.64±0.440.94±0.624.23±1.820.38±0.190.34±0.31 16.28±2.820.75±0.481.16±0.893.70±1.830.53±0.230.42±0.37 1.55.42±2.800.92±0.561.83±0.853.30±1.570.53±0.170.48±0.30 24.71±2.990.99±0.712.04±1.092.95±1.470.63±0.210.58±0.32 34.55±2.721.44±0.912.27±1.042.32±0.900.83±0.280.72±0.33 43.33±1.011.96±0.852.80±1.932.09±1.070.88±0.340.82±0.37 62.26±0.932.32±1.071.87±0.751.35±0.760.84±0.460.73±0.36 81.58±0.751.81±0.771.46±0.561.00±0.690.84±0.490.78±0.31 121.02±0.631.00±0.360.91±0.270.56±0.290.53±0.260.55±0.22 160.73±0.440.78±0.250.56±0.170.39±0.230.46±0.210.52±0.27 240.35±0.230.36±0.080.29±0.070.20±0.200.30±0.150.31±0.12 360.18±0.130.14±0.010.12±0.040.10±0.070.12±0.050.12±0.07 480.12±0.060.10±0.030.09±0.040.07±0.030.12±0.080.08±0.05 720.08±0.040.07±0.030.06±0.040.10±0.100.05±0.030.04±0.02

表4 禁食組、非禁食組豬單劑量靜注鹽酸金霉素溶液（10.0 mg·kg-1 b.w.）與灌服金霉素微囊顆粒（40.0 mg·kg-1b.w.）后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±SD, n=8）

3 討論

在禁食和非禁食的情況下，V/F結(jié)果表明：金霉素分布廣泛，與豬禁食和非禁食情況下靜注鹽酸金霉素（11 mg·kg-1）后V/F分別為0.97和1.39 L·kg-1比較[16]，顯示出相似的分布特征。在其他動(dòng)物亦可見(jiàn)相似的特征，但存在一定的種屬差異，如荷斯坦牛、育肥雞的V/F分別為40.9、1.63 L·kg-1[15, 23]。t1/2結(jié)果表明：金霉素在豬體內(nèi)消除慢，高于方炳虎等報(bào)道的金霉素在雞體內(nèi)的消除半衰期[17]，也顯著高于金霉素在育肥雞（靜注7.96 h，口服13.15 h）[14]的半衰期，與Reinbold報(bào)道的荷斯坦牛（灌服16.2 h）[15]的消除半衰期近似。金霉素通過(guò)膽汁排泄，部分可以在腸內(nèi)被重新吸收[24]，這可能是導(dǎo)致金霉素在動(dòng)物體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)的原因。禁食組和非禁食組豬灌服藥物后，禁食組達(dá)峰濃度和達(dá)峰時(shí)間與Nielsen等報(bào)道的（2.4±1.1）mg·mL-1、（3.7±1.9）h相似，非禁食組達(dá)峰濃度與報(bào)道的0.8mg·mL-1相似，但達(dá)峰時(shí)間比3.2 h明顯延遲[13]。試驗(yàn)中金霉素在禁食組和非禁食組豬中的生物利用度均較低，金霉素通過(guò)腸道少部分吸收，禁食組生物利用度稍高于非禁食組，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與Kilroy等報(bào)道鹽酸金霉素在禁食組和非禁食組豬中的F[（19.12±8.3）%、（17.88±5.32）%]相似[16]，但高于Nielsen等報(bào)道的豬灌服鹽酸金霉素后的F [（11±5）%、（6±2）%）][13]。Jerome 通過(guò)對(duì)金霉素在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行Mantel Haenszel分析發(fā)現(xiàn)豬對(duì)金霉素的生物利用度隨飼料中鈣含量的增高而降低，由17%降至9%[25]。而本研究Cmax和F說(shuō)明飼料雖然可以影響金霉素的吸收速率，但對(duì)金霉素在豬胃腸道中的吸收量未表現(xiàn)顯著影響，這可能與金霉素微囊化后，藥物以分子狀態(tài)在腸道緩慢釋放、被吸收，從而減少飼料對(duì)藥物的影響有關(guān)。

金霉素抗菌作用較廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（鏈球菌、炭疽桿菌、葡萄球菌、破傷風(fēng)桿菌）、革蘭氏陰性菌（巴氏桿菌、沙門氏菌、嗜血桿菌）及一些衣原體、支原體、立克次體、螺旋體具有一定的抗菌活性。非禁食組中，40 mg·kg-1b.w.單劑量給豬灌服15%微囊金霉素后，約8 h后達(dá)到最高血藥濃度0.95mg·mL-1，至12、24 h血漿中藥物濃度仍可維持0.55、0.31mg·mL-1。同樣單劑量灌服10%金霉素微囊顆粒后，約6 h后達(dá)到最高血藥濃度1.02mg·mL-1、至12、24 h血漿中藥物濃度仍可維持0.53、0.30mg·mL-1。金霉素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌等臨床分離菌的MIC分別為4、0.0625、4和2mg·mL-1[26]，對(duì)豬肺炎支原體的MIC為1.25mg·mL-1[27]，Hayer評(píng)估美國(guó)2006至2016年副豬嗜血桿菌對(duì)13種抗菌素的耐藥率變化，其中金霉素對(duì)副豬嗜血桿菌的MIC90為1mg·mL-1[28]。無(wú)論禁食組還是非禁食組，金霉素在體內(nèi)的表觀分布容積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1 L·kg-1，有報(bào)道金霉素在膽汁中的濃度是在血清中觀測(cè)到的濃度的8至16倍[29]，藥物的組織濃度要高于血漿濃度，藥物在體內(nèi)分布廣泛[30]。此外，日糧中添加75和150mg·kg-1的金霉素，腹瀉率下降22.1%和52.23%[6]。對(duì)此，按40 mg·kg-1添加金霉素微囊顆粒，可用于預(yù)防敏感菌導(dǎo)致的豬腸道和呼吸道疾病。

4 結(jié)論

豬灌服金霉素微囊顆粒后，藥物在體內(nèi)吸收緩慢、分布廣、消除較慢、生物利用度較低，與禁食組相比，非禁食組生物利用度偏低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明飼料不影響金霉素微囊顆粒在豬胃腸道中的吸收，但會(huì)改變金霉素進(jìn)入體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

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Pharmacokinetics of Chlortetracycline Microspheres in Pigs

XU Ying, YAN ChangYan, YANG WeiCong, ZHANG YunXiao, YU Yang, HUANG XianHui

(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

【Objective】A method was developed for the determination of chlortetracycline in swine plasma with high- performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The pharmacokinetics of chlortetracycline in pigs, including chlortetracycline hydrochloride, 10% chlortetracycline microspheres and 15% chlortetracycline microspheres were studied.【Method】Pharmacokinetics of chlortetracycline were investigated after intravenous and oral administration to pigs. Sixteen cross-bred pigs(Duroc×Landrace×Yorkshire) weighing (20±2.5) kg received a dose of 10 mg·kg-1of chlortetracycline hydrochloride intravenously and 40 mg·kg-1of 10% chlortetracycline microspheres and 15% chlortetracycline microspheres orally in both the fasted and the feeding condition in a three-way crossover design with one week washout period between each administration. Blood samples were collected in different time set before the experiment.The swine plasma samples were ultrasonic extracted with 0.1 mol·L-1Na2EDTA-McIlvaine buffer. Then the extract was loaded on the HLB solid phase extraction (SPE) cartridge. After evaporation by nitrogen with water bath at 35℃, the extract was redissolved with methanol. Chlortetracycline was separated using a CNW C18 column with a mobile phase of acetonitrile -0.1% formic acid. The mobile phase was gradient elution at the flow rate of 0.25 mL·min-1. Chlortetracycline was analyzed by mass spectrometry equipped with electrospray ionization in the multiple reaction monitoring and positive ion mode and determined by an external standard quantitation. In the range of 5-500 ng·mL-1, the calibration curves of chlortetracycline from swine plasma showed good linearity (＞0.9990). The limit of detection (LOD) was 5 ng·mL-1and the limit of quantification (LOQ) was 10 ng·mL-1. The average recovery of chlortetracycline was 76.90%-89.25% at low, medium and high concentration while the inter-day and intra-day coefficient of variations were 2.97%-9.45% and 6.16%-13.39%, respectively. The method was accurate, sensitive and suitable for the determination of chlortetracycline in swine plasma.【Result】Chlortetracycline concentration-time data fitted to a non-compartment model were analyzed by WinNonlin5.2.1 pharmacokinetic program after intravenous and oral administration in both fasted and fed pigs. The main pharmacokinetic parameters for chlortetracycline hydrochloride in fasted pigs and feeding pigs were follows: AUC0-∞(57.42±23.53)mg·h·mL-1, (37.58±21.30)mg·h·mL-1; V/F (5.67±2.12) L·kg-1, (12.59±6.43) L·kg-1; MRT(13.87±2.00) h, (22.17±14.47) h; t1/2(19.93±5.26 ) h, (27.79±12.82) h, respectively. After receiving 10% chlortetracycline microspheres and 15% chlortetracycline microspheres without feeding, the parameters were as follows:AUC0-∞(34.46±10.28)mg·h·mL-1, (33.15±12.76)mg·h·mL-1; Cmax(2.48±1.05)mg·mL-1, (2.97±1.88)mg·mL-1, Tmax(4.88±1.25) h, (3.13±1.55) h; V/F (31.53±15.98) L·kg-1, (32.30±9.69) L·kg-1; MRT (19.93±3.83) h, (17.41±1.80) h; t1/2(16.87±3.49) h, (17.13±3.58) h; F(17.03±0.08) %, (15.82±5.16) %, respectively. In feeding group, after receiving 10% chlortetracycline microspheres and 15% chlortetracycline microspheres, the parameters were as follows: AUC0-∞(20.81±7.46)mg·h·mL-1, (19.72±5.69)mg·h·mL-1; Cmax(1.02±0.38)mg·mL-1, (0.95±0.32)mg·mL-1; Tmax(6.38±4.44) h, (8.00±5.24) h; V/F (52.40±22.90) L·kg-1，(52.47±19.69) L·kg-1; MRT (24.67±9.52) h, (23.37±4.21) h; t1/2(18.57±10.67) h, (16.64±5.12) h; F (16.07±6.78)%, (15.26±5.26)%, respectively. 【Conclusion】The results of studies showed that chlortetracycline was absorbed slowly, distributed widely and had slow elimination and low bioavailability in pigs after receiving chlortetracycline microspheres orally. Compared with the fasting group, 10% and 15% chlortetracycline microspheres in the feeding group reached a slower peak time and a lower peak concentration, while the apparent distribution volume was larger and the bioavailability was lower, but the difference was not significant. This result indicated the feed did not affect the absorption of chlortetracycline in the gastrointestinal tract of pigs, but changed the pharmacokinetic process of chlortetracycline entering the body.

chlortetracycline; pharmacokinetics; HPLC-MS/MS; pig

2019-10-30；

2020-06-30

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)（2016YFD0501306）、國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAD11B03-06）

許穎，E-mail：971238309@qq.com。通信作者黃顯會(huì)，E-mail：xhhuang@scau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）