桂雪兒，王 志，李思婷，賀濛初，朱 杰，馮士彬，吳金節(jié)，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230061； 2.宣城木子禽業(yè)專業(yè)合作社，安徽 宣城 242000)

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，定植于機(jī)體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能改善宿主微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用。截至目前，已有多種益生菌被應(yīng)用于家禽生產(chǎn)，應(yīng)用最多的是乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌。益生菌在腸道生長和定殖后，對腸道免疫產(chǎn)生重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，許多益生菌對機(jī)體免疫能產(chǎn)生刺激作用，腸道內(nèi)有益菌群數(shù)的增加可抑制有害菌群的生長繁殖，從而增強(qiáng)家禽的抗病能力和免疫能力[1-5]。Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是一類I型跨膜糖蛋白模式識別受體，通過識別病原相關(guān)分子模式激活天然免疫。髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，Myd88)是Toll樣受體信號通路中的關(guān)鍵接頭蛋白，起傳遞信息的作用。TLRs在家禽各個器官中都參與抗病原菌感染作用，其中Toll樣受體2(TLR2)和Toll樣受體4(TLR4)通過影響下游Myd88依賴通路，改變腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(tumor necrosis factor receptor-related factor-6，TRAF-6)和激活蛋白-1(activator protein，AP-1)表達(dá)，影響血清中免疫球蛋白含量[6-10]。

白羽肉雜雞父本是快大雞，母本是商品蛋雞，因其生長快速，常用于規(guī)?；a(chǎn)。為了提高白羽肉雜雞的抗病能力和免疫能力，基于同源益生菌適用性更優(yōu)原則，本試驗(yàn)從健康白羽肉雜雞腸道中分離乳酸菌和芽孢桿菌，經(jīng)液體發(fā)酵制成雞源復(fù)合益生菌制劑，旨在探討其對肉雞免疫球蛋白和Toll樣受體通路的影響，為雞源復(fù)合益生菌的臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)合益生菌為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供的分離篩選自白羽肉雜雞腸道中的乳酸菌BNCC134981和枯草芽孢桿菌L61，對其進(jìn)行液體發(fā)酵后實(shí)測有效活菌數(shù)為1×108CFU·mL-1。

1.2 試驗(yàn)飼糧

飼糧配制參考NRC(1994)家禽營養(yǎng)需要，基礎(chǔ)飼糧組成及其營養(yǎng)水平見表1。經(jīng)測算，配制的飼糧代謝能為13.26 MJ·kg-1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素完全隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將180只初始體質(zhì)量相近的白羽肉雞作為父本、海蘭白作為母本的28日齡健康白羽肉雜雞隨機(jī)分為3組，A組飼喂基礎(chǔ)飼糧，B組在基礎(chǔ)飼糧中添加1011CFU·kg-1益生菌，C組在基礎(chǔ)飼糧中添加2×1011CFU·kg-1益生菌，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20只，各重復(fù)初始體質(zhì)量無顯著差異。采用拌料喂雞，安徽宣城木子禽業(yè)專業(yè)合作社養(yǎng)雞場提供試驗(yàn)場地和試驗(yàn)動物。試驗(yàn)期21 d，按常規(guī)免疫程序進(jìn)行預(yù)防免疫。

1.4 樣本采集與處理

白羽肉雜雞34、41、48日齡時，頸靜脈采血，分離血清，-20 ℃保存。白羽肉雜雞48日齡時，每組隨機(jī)挑選5只體質(zhì)量相近的雞空腹屠宰，采集空腸樣品，放于-20 ℃冰箱中冷凍貯藏備用。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 免疫球蛋白ELISA檢測

按照ELISA試劑盒詳細(xì)步驟要求，檢測34、41、48日齡白羽肉雜雞血清IgG、IgM、IgA水平。

1.5.2 RT-qPCR法檢測空腸TLR2、TLR4、Myd88、TRAF-6、AP-1 mRNA相對表達(dá)量

Trizol法提取雞空腸RNA，使用分光光度計(jì)檢測RNA純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行qPCR檢測。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL，qPCR mix 10 μL，ddH2O 7 μL。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)所用特異性引物，并由南京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

表2 基因引物參數(shù)Table 2 Primer sequences of genes

1.5.3 Western blot法檢測空腸TLR2、TLR4、Myd88、TRAF-6、AP-1蛋白表達(dá)量

將空腸組織樣品在冰上研磨，加入混有蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，漩渦振蕩器混合均勻，置于冰上20 min，使細(xì)胞充分裂解，14 000×g離心10 min，收集上清液。蛋白濃度測定按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。將提取的蛋白質(zhì)樣品煮沸5 min，在SDS-PAGE凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用牛血清白蛋白(BSA)在室溫下封閉膜4 h后，放入一抗在4 ℃孵育過夜，將膜洗滌3次，并用二抗在室溫下水平振蕩孵育45 min，洗膜后放入凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)中成像。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，SPSS 23.0軟件進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05作為差異顯著性。Western blot結(jié)果采用AlphaEase FC軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對血清中免疫球蛋白含量的影響

由表3可知，與A組相比，B組和C組血清中IgG、IgM水平在34、41、48 d均顯著增加(P<0.05)；C組血清IgG、IgA和IgM水平與B組差異不顯著(P>0.05)。

表3 益生菌對雞血清免疫球蛋白水平的影響Table 3 Effect of probiotics on serum immunoglobulin levels of chicks μg·mL-1

2.2 益生菌對空腸TLR2、TLR4、Myd88、TRAF-6、AP-1m RNA相對表達(dá)量的影響

由圖1可知，與A組相比，B組空腸TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88、AP-1 mRNA相對表達(dá)量顯著(P<0.05)提高；C組空腸TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88、AP-1 mRNA相對表達(dá)量顯著(P<0.05)提高。C組空腸MyD88蛋白mRNA相對表達(dá)量比B組顯著(P<0.05)提高。

2.3 益生菌對TLR2、TLR4、Myd88、TRAF-6、AP-1蛋白表達(dá)量的影響

由圖2可知，與A組相比，B組和C組空腸TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88蛋白表達(dá)量顯著(P<

柱狀圖上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Difference lowercase letters above the columns represent significant difference at P<0.05. The same as below.圖1 益生菌對空腸TLR2、TLR4、AP-1、TRAF-6、Myd88 mRNA相對表達(dá)量影響Fig.1 Effect of probiotics on the relative expression of TLR2、TLR4、AP-1、TRAF-6、Myd88 mRNA in jejunum

圖2 益生菌對TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88、AP-1蛋白表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of probiotics on the protein expression of TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88、AP-1

0.05)提高；C組空腸的AP-1蛋白表達(dá)量顯著(P<0.05)高于A組。C組的TLR4、Myd88蛋白表達(dá)量比B組的顯著(P<0.05)提高。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加不同濃度的雞源復(fù)合益生菌能提高白羽肉雜雞血清中IgG和IgM含量，提高雞腸道中的TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88、AP-1蛋白的表達(dá)量和TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88、AP-1 mRNA的相對表達(dá)量，通過Toll樣受體通路增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

IgG、IgM、IgA是體液免疫的主導(dǎo)效應(yīng)分子，在體液免疫中起重要的作用，免疫球蛋白的含量也是衡量動物機(jī)體免疫機(jī)能的重要指標(biāo)。IgG由脾臟和淋巴組織中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，是體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，在增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面具有重要作用；IgM具有抗菌及中和毒素的作用；IgA以2種形式存在，具有多種抗體活性[11]。呂春炎[12]在肉雞飼糧中添加黃芪、女貞子和益生菌合用，肉雞的IgG、IgA、IgM均顯著提高；王元心[13]在雛雞飼糧中添加益生菌，其局部體液中免疫球蛋白含量不同程度高于對照雛雞；王佳麗等[14]等在肉雞飼糧中添加復(fù)合益生菌，顯著提高了免疫球蛋白的含量，改善了肉雞體液免疫功能。本試驗(yàn)分別在基礎(chǔ)日糧中添加雞源復(fù)合益生菌，在34、41、48 d檢測血清IgG、IgM、IgA水平。從本試驗(yàn)結(jié)果可得，添加雞源復(fù)合益生菌后，明顯增加血清中IgG和IgM含量，表明該復(fù)合益生菌可以促進(jìn)肉雞免疫球蛋白的分泌，增強(qiáng)體液免疫。

Toll樣受體是膜結(jié)合受體，可以識別細(xì)胞外微生物，并將信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)引起免疫反應(yīng)，在天然免疫反應(yīng)中不僅可以清除病原體，而且可通過識別病原體相關(guān)分子過程中有效建立獲得性免疫體系。Myd88是Toll樣受體通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，傳遞了多種不同受體的活化信號，其通過調(diào)節(jié)下游蛋白TRAF-6等信號分子，促使AP-1和其他激酶的活化，繼而導(dǎo)致相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，以此來參與機(jī)體的免疫反應(yīng)[15-20]。覃初斌等[21]在肉雞飼糧中添加布拉氏酵母和枯草芽孢桿菌B10，肉雞空腸黏膜Toll樣受體TLR2、TLR4和相關(guān)信號蛋白Myd88、TRAF-6等基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。彭承英[22]在肉雞飼糧中添加益生菌，35日齡肉雞空腸的TLR2基因表達(dá)水平顯著提高。從本試驗(yàn)結(jié)果可得，添加雞源復(fù)合益生菌后，腸道中的TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88、AP-1蛋白的表達(dá)量和TLR2、TLR4、TRAF-6、Myd88、AP-1蛋白mRNA的相對表達(dá)量都顯著提高，且添加雞源復(fù)合益生菌后，血清中的IgG、IgM含量也隨之升高。表明此復(fù)合益生菌改善了Toll樣受體通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高了血清中免疫球蛋白的水平，通過Toll樣受體通路有效調(diào)節(jié)肉雞腸道的免疫功能，促進(jìn)肉雞的健康生長。