劉 凱，馮曉宇，馬恒甲，謝 楠

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 水產(chǎn)研究所，浙江 杭州 310024)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，獨(dú)立于核基因組之外，具有結(jié)構(gòu)簡單、多拷貝、能夠獨(dú)立復(fù)制、編碼效率高、進(jìn)化速率快，且一般無組織特異性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種群遺傳、系統(tǒng)發(fā)育演化、適應(yīng)性進(jìn)化等領(lǐng)域中[1]。通過對魚類線粒體基因組的比對和分析，獲得了大量的魚類線粒體基因組數(shù)據(jù)，為魚類線粒體的起源與演化，以及種群遺傳、適應(yīng)性進(jìn)化等研究提供了新的方向與依據(jù)。

三角魴(MegalobramaterminalisRichardson)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，鲌亞科(Culterinae)，魴屬(Megalobrama)，自然分布于長江、黃河和黑龍江等水系[2]。由于過度捕撈及生態(tài)環(huán)境變化，三角魴野生資源量嚴(yán)重下降。錢塘江流域擁有一定的三角魴種質(zhì)資源且建有全國唯一的國家級三角魴原種場[3]，對三角魴種質(zhì)資源保護(hù)、增殖放流等工作較為重視。目前對于三角魴繁育、養(yǎng)殖技術(shù)的研究較多，而對它的線粒體基因組、系統(tǒng)進(jìn)化研究較少?；驕y序技術(shù)的深入發(fā)展，使其能夠廣泛應(yīng)用于三角魴的種質(zhì)研究。近年，有學(xué)者通過線粒體基因組序列特征探討了珠江流域[4]和黑龍江流域[5]的三角魴和團(tuán)頭魴(MegalobramaamblycephalaYih)、廣東魴(MegalobramahoffmanniRichardson)以及厚頜魴(Megalobramapellegrini Tchang)等4種魚類的種間關(guān)系，而對于錢塘江流域的三角魴則研究較少。本研究測定了錢塘江三角魴的線粒體全基因組序列，分析了其主要結(jié)構(gòu)特征，通過與珠江流域和黑龍江流域三角魴線粒體基因組的BLAST比較及遺傳距離分析，表明不同流域間三角魴存在遺傳學(xué)差異；通過比對包括錢塘江三角魴在內(nèi)的15種鲌亞科魚類的線粒體基因組，構(gòu)建了鲌亞科魚類的系統(tǒng)進(jìn)化樹，探討了不同流域間三角魴的親緣關(guān)系，以及三角魴與團(tuán)頭魴等其他魴屬魚類的親緣關(guān)系。該研究結(jié)果為錢塘江三角魴的種質(zhì)鑒定、地理種群劃分和親緣關(guān)系鑒定等方面提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及DNA提取

以國家級錢塘江三角魴原種場保存的錢塘江三角魴為材料。采集鰭條組織樣品，用無水乙醇固定，置于-20 ℃的冰箱中存儲備用。使用柱式動物組織基因組DNA提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)，按照試劑盒使用說明書步驟提取總DNA，分別提取3個樣本的總DNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 基因測序

基于GenBank中團(tuán)頭魴(EU434747)和采集自珠江流域[4](JX242528)以及黑龍江流域[5](MH289765)的三角魴線粒體基因組全序列，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增了錢塘江三角魴線粒體基因組全序列的19對引物(表1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后用大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行TA克隆，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆送往上海派森諾生物科技有限公司，使用ABI 3730XL型號測序儀進(jìn)行測序。

表1 錢塘江三角魴線粒體基因組序列擴(kuò)增使用的引物序列Table 1 Sequences of primers used in amplification of complete mitochondrial genome of Megalobrama terminalis from Qiantang River

1.3 序列拼接與分析

使用UGENE軟件[6]的CAP3組件進(jìn)行序列拼接，獲得了錢塘江三角魴線粒體基因組全序列。通過BLAST[7]同源序列檢索并使用UGENE軟件[6]，分析了錢塘江三角魴線粒體基因組的蛋白編碼基因、rRNA基因、tRNA基因和非編碼區(qū)，以及統(tǒng)計了序列長度、堿基組成、GC含量等信息。利用RNAcentral網(wǎng)站[8]的Auto Traveler軟件(https://rnacentral.orghelpsecondary-structure)繪制rRNA二級結(jié)構(gòu)。使用tRNA scan-SE軟件[9](http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)預(yù)測tRNA的位置及二級結(jié)構(gòu)，使用VARNA軟件[10]繪制二級結(jié)構(gòu)圖。利用Mfold軟件[11](http://unafold.rna.albany.edu/？q=mfold/DNA-Folding-Form)預(yù)測莖環(huán)結(jié)構(gòu)。使用RepeatMasker軟件[12](http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker)搜索并標(biāo)記重復(fù)序列。使用MitoAnnotator[13]軟件(http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/annotation/input.html)進(jìn)行線粒體基因組注釋并結(jié)合相關(guān)物種信息加以校正。使用CGview軟件[14](http://cgview.ca/)繪制線粒體基因組圖譜及Blast比較圓形圖。利用MEGA X軟件[15]計算相對同義密碼子使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)，以對密碼子使用偏好進(jìn)行評估。如果密碼子使用無偏好性，則RSCU值為1；如果該密碼子比其他密碼子使用頻率高，則RSCU值大于1；反之RSCU值小于1[16]。利用MEGA X軟件[15]基于線粒體基因組全序列計算相對遺傳距離(pairwise distances)。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組結(jié)構(gòu)與組成

錢塘江三角魴線粒體基因組序列經(jīng)注釋后提交GenBank(登錄號：MN725725)。在其線粒體基因組中存在2個散在的重復(fù)序列，分別位于D-loop區(qū)的15 705～15 758 bp和16 498～16 517 bp位置；含有22個tRNA基因、2個rRNA基因和13個蛋白編碼基因(圖1)。錢塘江三角魴線粒體基因組序列全長為16 621 bp，其堿基組成為A(31.23%)、G(16.17%)、C(27.87%)和T(24.73%)；A+T含量(55.97%)高于G+C含量(44.03%)，表明錢塘江三角魴線粒體基因組具有AT偏好性。

圖1 錢塘江三角魴線粒體基因組圖譜Fig.1 Map of complete mitochondrial genome of Megalobrama terminalis from Qiantang River

不同物種其線粒體基因的起止位置、長度和所在鏈有所不同，表2展示了錢塘江三角魴所有rRNA基因、tRNA基因、蛋白編碼基因和非編碼區(qū)的長度、起止位置和編碼鏈，以及蛋白編碼基因的起始密碼子與終止密碼子等信息。

表2 錢塘江三角魴線粒體基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Table 2 Characteristics of complete mitochondrial genome of Megalobrama terminalis from Qiantang River

2.2 rRNA與tRNA編碼基因結(jié)構(gòu)特征

錢塘江三角魴線粒體包含兩個rRNA，分別為12S rRNA和16S rRNA，兩者均位于H鏈上。12S rRNA在線粒體序列上的位置為70～1 030 bp，16S rRNA在線粒體序列上的位置為1 103～2 794 bp，兩個rRNA之間夾著1個tRNA-Val基因。以CRW[18]網(wǎng)站提供的鯉魚(CyprinuscarpioLinnaeus)線粒體12S rRNA(b.16.m.C.carpio)文件為模板，利用Auto Traveler軟件繪制了錢塘江三角魴線粒體12S rRNA二級結(jié)構(gòu)(圖2)，此二級結(jié)構(gòu)中第Ⅰ、第Ⅱ結(jié)構(gòu)域稱為可變區(qū)，而第Ⅲ、第Ⅳ結(jié)構(gòu)域則為保守區(qū)。與鯉魚相比，錢塘江三角魴線粒體12S rRNA在第Ⅰ、第Ⅱ結(jié)構(gòu)域多處出現(xiàn)堿基的替換、插入與重排現(xiàn)象，而第Ⅲ、第Ⅳ結(jié)構(gòu)域則相對較少。以人(HomosapiensLinnaeus)線粒體16S rRNA(mHS_LSU_3D)文件為模板，利用Auto Traveler軟件繪制了錢塘江三角魴線粒體16S rRNA二級結(jié)構(gòu)，此二級結(jié)構(gòu)由6個結(jié)構(gòu)域組成(圖3)，其中第Ⅰ-Ⅲ、第Ⅵ結(jié)構(gòu)域稱為可變區(qū)，而第Ⅳ、第Ⅴ結(jié)構(gòu)域則為保守區(qū)。對比12S rRNA和16S rRNA的二級結(jié)構(gòu)圖可以發(fā)現(xiàn)，與16S rRNA基因相比，12S rRNA基因會顯得更加保守。此外，從二級結(jié)構(gòu)圖中也可發(fā)現(xiàn)，rRNA莖區(qū)的堿基序列比環(huán)區(qū)的堿基序列要相對保守，較少出現(xiàn)堿基的替換、插入與重排現(xiàn)象。

以CRW[18]網(wǎng)站提供的鯉魚(Cyprinus carpio Linnaeus)線粒體12S rRNA(b.16.m.C.carpio)文件為模板，利用Auto Traveler軟件繪制。黑色表示堿基與模板相同，綠色表示堿基與模板不同，紅色表示插入的堿基，藍(lán)色表示堿基的重排。Using the Cyprinus carpio Linnaeus mitochondrial 12S rRNA(b.16.m.C.carpio) file provided on the CRW[18] website as a template， it was drawn using Auto Traveler software. Black indicated that the base was the same as the template， green indicated that the base was different from the template， red indicated the inserted base， and blue indicated the reinsertion of the base.圖2 錢塘江三角魴線粒體12S rRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.2 Predicted secondary structure of mitochondrial 12S rRNA of Megalobrama terminalis from Qiantang River

以人(Homo sapiens Linnaeus)線粒體16S rRNA(mHS_LSU_3D)文件為模板，利用Auto Traveler軟件繪制。黑色表示堿基與模板相同，綠色表示堿基與模板不同，紅色表示插入的堿基，藍(lán)色表示堿基的重排。A Homo sapiens mitochondrial 16S rRNA(mHS_LSU_3D) file was used as a template and it was drawn using Auto Traveler software. Black indicated that the base was the same as the template， green indicated that the base was different from the template， red indicated the inserted base， and blue indicated the reinsertion of the base.圖3 錢塘江三角魴線粒體16S rRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.3 Predicted secondary structure of mitochondrial 16S rRNA of Megalobrama terminalis from Qiantang River

與大多數(shù)魚類線粒體類似[1]，錢塘江三角魴線粒體也包含22個tRNA基因，其序列長度從69 bp到76 bp不等，tRNA基因序列的總長度達(dá)到了1 566 bp(表2)。22個tRNA基因中，有2個tRNA-Ser(UCN，AGY)和2個tRNA-Leu(UUR，CUN)；tRNA-Ser的反密碼子分別為UGA和GCU，tRNA-Leu的反密碼子分別為UAA和UAG。8個tRNA(tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser(UCN)、tRNA-Glu和tRNA-Pro)位于L鏈上，其余14個tRNA則位于H鏈上。tRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，錢塘江三角魴線粒體中tRNA-Phe、tRNA-Val、tRNA-Leu(UUR)(圖4)等21個tRNA均可形成典型的三葉草型二級結(jié)構(gòu)，而tRNA-Ser(AGY)由于缺失二氫尿嘧啶臂(D臂)而不能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)(圖5)。tRNA scan-SE軟件預(yù)測tRNA-Ser(AGY)的二級結(jié)構(gòu)時，61號堿基G未與43號堿基C配對，卻與44號堿基C形成配對，從而造成60號堿基未形成配對(圖5-A)。比對mitotRNAdb數(shù)據(jù)庫[20]上斑馬魚(DaniorerioHamilton)tRNA-Ser(AGY)的二級結(jié)構(gòu)，tRNA-Ser(AGY)61號堿基G應(yīng)該與43號堿基C形成了配對，而48號堿基G與56號堿基C則未形成配對(圖5-B)，否則tRNA-Ser(AGY)T臂的莖上將形成6個堿基對，而魚類tRNA-Ser(AGY)T臂的莖上只有5個堿基對[21]。此外，在tRNA的二級結(jié)構(gòu)中擺動配對現(xiàn)象比較常見[22]，如tRNA-Leu(UUR)的7號堿基G與69號堿基U形成配對。在人線粒體tRNA-Leu(UUR)D臂上存在一段13堿基構(gòu)成的功能DNA序列Motif(5′-TGGCAGAGCCCGG-3′)，是線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子(mTERF)的結(jié)合位點(diǎn)[23]，參與調(diào)節(jié)2個rRNA和H-鏈下游基因的轉(zhuǎn)錄水平[24]，在錢塘江三角魴線粒體基因tRNA-Leu(UUR)D臂上也存在一段類似的Motif(5′-TGGCAGAGCATGG-3′)，其主要堿基組成和排列順序與人的Motif類似，僅僅是在第10、11位置的堿基與人有差異，表明該Motif很可能具有類似功能。

圖4 錢塘江三角魴線粒體tRNA-Leu(UUR)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.4 Predicted secondary structure of mitochondrial tRNA-Leu(UUR) of Megalobrama terminalis from Qiantang River

A，tRNA scan-SE軟件預(yù)測的tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)；B，重新繪制的tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)。A， The secondary structure of tRNA-Ser(AGY) predicted by tRNA scan-SE; B， The secondary structure of tRNA-Ser(AGY) redrawn.圖5 錢塘江三角魴線粒體tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.5 Predicted secondary structure of mitochondrial tRNA-Ser(AGY) of Megalobrama terminalis from Qiantang River

2.3 非編碼區(qū)

線粒體中的非編碼區(qū)，在調(diào)節(jié)線粒體DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起到非常重要的作用[1]。與大多數(shù)魚類線粒體類似，錢塘江三角魴線粒體的非編碼區(qū)也包含2段，其中一段被稱為控制區(qū)(control region)，又叫作D-loop區(qū)(displacement-loop region)，另一段則被稱為L-鏈復(fù)制起始區(qū)，又叫作OL區(qū)(origin of L-strand replication region)[1]。此外，錢塘江三角魴線粒體的非編碼區(qū)還含有12個基因間隔序列，其長度從1 bp到13 bp不等，其中最長的序列間隔位于tRNA-Asp基因和COX2基因之間，其長度達(dá)到了13 bp。由5個tRNA基因串聯(lián)組成的區(qū)域被稱為WANCY區(qū)[25]，位于此區(qū)域的tRNA-Asn基因和tRNA-Cys基因之間有一段啟動L-鏈復(fù)制的序列，此序列即是OL區(qū)，該序列與tRNA-Asn基因和tRNA-Cys基因的部分序列可組成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖有12 bp，環(huán)有11 nt(圖6)。在這個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5′端(tRNA-Cys基因這一側(cè))，有一段保守的功能DNA序列Motif(5′-GCCGG-3′)，其對L-鏈的復(fù)制至關(guān)重要[26]，錢塘江三角魴線粒體中也具有這個結(jié)構(gòu)(圖6方框所示)，與斑馬魚線粒體OL區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)也非常類似[21，27]。

圖6 錢塘江三角魴線粒體L-鏈復(fù)制起始區(qū)莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.6 Predicted secondary structure of origin of L-strand replication region of Megalobrama terminalis from Qiantang River

錢塘江三角魴線粒體的D-loop區(qū)長度為937 bp，G+C含量為35.75%，低于A+T含量(64.25%)，具有明顯的AT偏好性，這個現(xiàn)象與其他脊椎動物以及魚類線粒體控制區(qū)的堿基含量相似[1，28]。魚類線粒體基因組變異大多發(fā)生在D-loop區(qū)，該區(qū)域位于tRNA-Pro基因和tRNA-Phe基因之間[1]，一般可分為3個區(qū)段：分別為終止結(jié)合序列區(qū)(terminal associated sequences，TAS)，中央保守區(qū)(central domain，CD)和保守序列區(qū)(conserved sequence blocks，CSB)[1，28]。根據(jù)已報道的魴屬魚類D-loop區(qū)的結(jié)構(gòu)特征[29]，對錢塘江三角魴線粒體D-loop區(qū)的相關(guān)區(qū)段進(jìn)行了識別(圖7)。錢塘江三角魴線粒體D-loop區(qū)中TAS區(qū)的長度為76 bp，并在TAS區(qū)的前端發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)重復(fù)序列(圖8-A)，其可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖8-B)，此外還發(fā)現(xiàn)該重復(fù)序列包含一段5堿基構(gòu)成的功能DNA序列Motif(5′-TACAT-3′)，其被認(rèn)為是D-loop區(qū)DNA轉(zhuǎn)錄終止的候選位點(diǎn)[30]。錢塘江三角魴線粒體D-loop區(qū)中CD區(qū)的關(guān)鍵序列包括CSB-F、CSB-E、CSB-D這3個區(qū)段，CSB-F是區(qū)分TAS區(qū)和CD區(qū)的標(biāo)志，CSB-E關(guān)鍵序列中含有GTGGG-box[31]的類似序列GAGGG，CSB-D與其他魚類的相應(yīng)序列也比較類似[21，29，31]。CSB區(qū)一般含有3個保守序列CSB-1、CSB-2和CSB-3。CSB-1一般在脊椎動物中普遍存在[28，32]，可作為CSB區(qū)和CD區(qū)的分界標(biāo)志，錢塘江三角魴線粒體CSB-1的序列為ATTATTAAAAGACATA。CSB-2和CSB-3序列要比CSB-1序列保守，因此較容易識別，該CSB-2和CSB-3序列分別為CAAACCCCCCTACCCCC和TGTCAAACCCCGAAACCAA。此外，在D-loop區(qū)的近3′端也發(fā)現(xiàn)一個重復(fù)序列，這在康氏似鲹(ScomberoidescommersonnianusLacepède)[33]和黃條鰤(SeriolaaureovittataValenciennes)[34]等其他魚類中也有存在。

圖7 錢塘江三角魴線粒體控制區(qū)序列Fig.7 Control region sequences of Megalobrama terminalis from Qiantang River

2.4 蛋白編碼基因

錢塘江三角魴線粒體包含13個蛋白編碼基因，基因長度從165 bp到1 836 bp不等，基因總長度達(dá)到11 422 bp，占基因組總長度的68.72%，其中NAD6基因編碼于L鏈上，而其他12個蛋白基因則編碼于H鏈上(表2)。13個蛋白基因中，COX1基因的起始密碼子是GTG，而其他12個基因的起始密碼子則都為ATG；終止密碼子最多的是TAA，共有6個，ATP6、COX3和NAD4的終止密碼子為不完全的TA-，剩余基因?yàn)椴煌耆慕K止密碼子T--。此外，蛋白編碼基因之間存在重疊現(xiàn)象，例如ATP6基因和ATP8基因之間有7 bp重疊，NAD4L基因和NAD4基因之間也有7 bp重疊，NAD5與NAD6之間則有4 bp重疊。

錢塘江三角魴線粒體中所有蛋白編碼基因的A+T含量均高于50%(表3)，A+T總含量達(dá)到了55.86%，表明蛋白編碼基因具有AT偏好性。由于錢塘江三角魴線粒體的A+T含量為55.97%，可見非蛋白編碼區(qū)也具有AT偏好性。密碼子使用偏好性分析表明，在13個蛋白編碼基因中存在32個偏好密碼子(表4)，其中第3位點(diǎn)為A或T(U)的密碼子中相對密碼子使用頻率(relative synonymous codon usage，RSCU)大于1的密碼子有65.63%，第3位點(diǎn)為C或G的密碼子中RSCU大于1的密碼子只有34.38%，說明第3位點(diǎn)為A或T(U)的密碼子普遍具有較高的使用頻率。而在錢塘江三角魴線粒體中，密碼子第3位堿基為A或T(U)的密碼子出現(xiàn)的總概率也達(dá)到了62.50%，而RSCU也均大于1(除了UUU(F)、CUU(L)、CCU(P)、ACU(T)、GCU(A)、CAU(H)、GAU(D)、UGU(C)、CGU(R)、AGU(S)、AGA(*)、GGU(G)等密碼子之外)，以上結(jié)果表明，線粒體密碼子第3位點(diǎn)對A、T(U)的偏好性與蛋白編碼基因密碼子第3位點(diǎn)對A、T(U)偏向性一致。

表3 錢塘江三角魴13個蛋白編碼基因堿基組成Table 3 Nucleotide composition of thirteen protein-coding genes of Megalobrama terminalis from Qiantang River

表4 錢塘江三角魴13個蛋白編碼基因密碼子使用頻率Table 4 Total codon average usage in the thirteen protein-coding genes of Megalobrama terminalis from Qiantang River

2.5 不同流域三角魴線粒體基因組比較

基于線粒體基因組全序列的測定，比較了珠江流域[4](JX242528)以及黑龍江流域[5](MH289765)的三角魴和采自錢塘江流域的2個三角魴樣本的線粒體基因組(MN725725、MH289767)的一致性和遺傳距離。2個錢塘江三角魴樣本均采集自國家級錢塘江三角魴原種場，一個為2011年保存的樣品(MN725725)，一個為2017年保存的樣品[5](MH289767)。經(jīng)BLAST

A，RepeatMasker軟件在TAS區(qū)前端標(biāo)記的串聯(lián)重復(fù)序列；B，Mfold軟件預(yù)測的串聯(lián)重復(fù)序列的二級結(jié)構(gòu)。A， The tandem repeat sequence marked by the RepeatMasker in the front of the TAS area; B， The secondary structure of the tandem repeat sequence predicted by the Mfold.圖8 錢塘江三角魴線粒體終止結(jié)合序列區(qū)中的重復(fù)序列Fig.8 Repeat sequences in terminal associated sequences of Megalobrama terminalis from Qiantang River

比較(圖9)，2個錢塘江三角魴樣本序列一致性達(dá)到99.98%，與黑龍江流域三角魴(MH289765)一致性為99.76%，與珠江流域三角魴[4](JX242528)一致性達(dá)到了99.87%，與廣東魴[4](JX242530)一致性為96.06%?；诰€粒體基因組序列間遺傳距離分析(表5)也表明，采自錢塘江流域的2個三角魴樣本的線粒體基因組具有更近的遺傳距離，錢塘江三角魴(MN725725、MH289767)與珠江流域三角魴[4](JX242528)之間的遺傳距離要比錢塘江三角魴(MN725725、MH289767)與黑龍江流域的三角魴(MH289765)之間遺傳距離更近。此外，基于BLAST比較圓形圖可發(fā)現(xiàn)，2個錢塘江三角魴樣本線粒體基因組(MN725725、MH289767)差異堿基分別位于NAD1，tRNA-Lys和NAD5基因中。

表5 基于線粒體基因組全序列分析不同流域三角魴相對遺傳距離Table 5 Analysis of pairwise distances of Megalobrama terminalis in different basin based on complete mitochondrial genome

2.6 線粒體基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析

圓環(huán)由外及里依次代表錢塘江三角魴MN725725，錢塘江三角魴MH289767，珠江三角魴JX242528，黑龍江三角魴MH289765，廣東魴JX242530。The circle from outside to inside， represented Megalobrama terminalis from Qiantang River MN725725， Megalobrama terminalis from Qiantang River MH289767， Megalobrama terminalis from Pearl River JX242528， Megalobrama terminalis from Heilong River MH289765， and Megalobrama hoffmanni JX242530.圖9 基于BLAST的線粒體基因組序列一致性圓形圖Fig.9 Pie chart of the nucleotide percent identity of complete mitochondrial genomes determined by BLAST

續(xù)表5 Continued Table 5

3 討論

本研究測定了錢塘江三角魴線粒體全長，其序列長度達(dá)到16 621 bp，A+T含量為55.97%，堿基含量呈現(xiàn)出AT偏好性。線粒體堿基中G的含量為16.17%，與其他魴屬魚類[4-5，29]以及太平洋鱈(GadusmacrocephalusTilesius)(16.9%)[30]、黃條鰤(16%)[34]等其他魚類線粒體中堿基G的含量接近；堿基A、C、T的含量分別為31.23%、27.87%、24.73%，與其他魚類以及哺乳動物的堿基組成類似[1，28]。這種堿基的偏好性，可能是自然突變以及選擇壓力等原因造成的[35]。

錢塘江三角魴線粒體具有標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量的22個tRNA，其長度從69 bp到76 bp不等，除了tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)由于缺失D臂而不能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)，其他tRNA均可形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)。tRNA二級結(jié)構(gòu)一般采用tRNA scan-SE軟件[9]和RNAstructure軟件[36]進(jìn)行預(yù)測，但tRNA scan-SE軟件[9]和RNAstructure軟件[36]預(yù)測并不十分準(zhǔn)確，如太平洋鱈[30]、黃條鰤[34]和蘭州鲇(SiluruslanzhouensisChen)[37]中關(guān)于tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測并不符合多數(shù)魚類tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)的認(rèn)識[21]。目前并沒有關(guān)于魴屬魚類線粒體tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)的分析，因此本研究結(jié)合mitotRNAdb數(shù)據(jù)庫[20]上發(fā)布的斑馬魚tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)，對tRNA scan-SE軟件[9]預(yù)測結(jié)果進(jìn)行了修正，從而確定了錢塘江三角魴線粒體tRNA-Ser(AGY)二級結(jié)構(gòu)。此外，與人線粒體tRNA-Leu(UUR)序列比較，本研究預(yù)測了錢塘江三角魴線粒體基因tRNA-Leu(UUR)D臂上存在一個Motif(5′-TGGCAGAGCATGG-3′)，其可能參與線粒體的轉(zhuǎn)錄與終止，這對于進(jìn)一步研究三角魴線粒體功能具有一定意義。

錢塘江三角魴線粒體基因組中12S rRNA和16S rRNA均為單拷貝且基因內(nèi)部無間隔區(qū)，且存在串聯(lián)重復(fù)序列，以及序列插入與缺失等現(xiàn)象，這些均符合后生動物的特征[34，38]，也是物種進(jìn)化的象征[34]。RNA由于其獨(dú)特的化學(xué)特性和進(jìn)化地位，其二級結(jié)構(gòu)與其功能息息相關(guān)，因此RNA二級結(jié)構(gòu)在RNA的功能和系統(tǒng)學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，而在其中又以rRNA基因最為常見[39]。由于生物序列復(fù)雜多樣，rRNA結(jié)構(gòu)預(yù)測仍是生物信息學(xué)中的一道難題，目前關(guān)于魚類12S rRNA和16S rRNA二級結(jié)構(gòu)分析的文獻(xiàn)也相對較少。毛明光等[30]、史寶等[34]對太平洋鱈、黃條鰤線粒體基因組中12S rRNA和16S rRNA僅僅從堿基組成上進(jìn)行了簡單分析，連總強(qiáng)等[37]則參照黑尾地鴉(PodoceshendersoniHume)12S rRNA 和麥穗魚(PseudorasboraparvaTemminck & Schlegel)16S rRNA基因二級結(jié)構(gòu)繪制了蘭州鲇的12S rRNA和16S rRNA二級結(jié)構(gòu)。賴瑞芳等[4]和Hu等[5]關(guān)于魴屬魚類12S rRNA和16S rRNA也是從堿基組成上進(jìn)行了簡單分析，而本研究則利用RNAcentral網(wǎng)站[8]的Auto Traveler軟件，基于鯉魚線粒體12S rRNA(b.16.m.C.carpio)文件和人線粒體16S rRNA(mHS_LSU_3D)文件，對錢塘江三角魴線粒體基因組中12S rRNA和16S rRNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，這為進(jìn)一步研究三角魴rRNA結(jié)構(gòu)與功能提供了基礎(chǔ)資料。

錢塘江三角魴D-loop區(qū)的前端和后端共發(fā)現(xiàn)了2個串聯(lián)重復(fù)序列。關(guān)于串聯(lián)重復(fù)序列形成的機(jī)制觀點(diǎn)眾多[40]，如重組和轉(zhuǎn)座、不等交換或基因轉(zhuǎn)換、滑鏈以及非正常延長等。由于脊椎動物線粒體DNA中一般不發(fā)生重組現(xiàn)象[41]，蔡珊珊等[40]認(rèn)為，滑鏈錯配是串聯(lián)重復(fù)序列形成的主要原因，這在核基因中同樣存在[42]。D-loop區(qū)中的TAS區(qū)是魚類線粒體中變異積累最多的區(qū)域，重復(fù)序列也多發(fā)生在TAS區(qū)。這在錢塘江三角魴，康氏似鲹[33]，黃條鰤[34]以及黃鯽(SetipinnatenuifilisValenciennes)[40]等魚類中均有發(fā)現(xiàn)，且在康氏似鲹[33]D-loop區(qū)內(nèi)存在多個TAS區(qū)。錢塘江三角魴線粒體D-loop區(qū)的CSB區(qū)的關(guān)鍵序列CSB-F、E、D，與其他魚類[4-5，29，33-34，40]CSB區(qū)的關(guān)鍵序列也比較類似，且CSB-E關(guān)鍵序列中含有GTGGG-box[31]的類似序列GAGGG。CSB-D被認(rèn)為可能與H-鏈的復(fù)制[43]和D-loop的起始[44]有關(guān)，還可能與線粒體的代謝有關(guān)[31]。因此，CSB區(qū)被認(rèn)為是整個D-loop區(qū)最關(guān)鍵的部分[32]。本文研究的錢塘江三角魴具有哺乳動物上所描述的CSB1特征序列(GACATA)[32]，這與鲹科魚類和鱸形目魚類有所差別[33]。此外，錢塘江三角魴線粒體D-loop區(qū)中不僅發(fā)現(xiàn)了CSB1，還發(fā)現(xiàn)了CSB2和CSB3這2個保守序列，這在康氏似鲹[33]、黃條鰤[34]以及黃鯽[40]等魚類中均有發(fā)現(xiàn)，而CSB2和CSB3在哺乳動物的D-loop區(qū)中卻不是普遍存在的[28，32]，這也表現(xiàn)出了魚類與哺乳動物的差異性。

20世紀(jì)50年代以前，魴屬一直被認(rèn)為在我國境內(nèi)只有1個種，魴，通常稱為平胸鳊，拉丁名為Megalobramaterminalis。一直到1955年，易伯魯撰文表示，魴屬魚類在我國境內(nèi)至少有2個種，三角魴和團(tuán)頭魴，三角魴沿用原來魴的拉丁名，而團(tuán)頭魴則使用了新的拉丁名Megalobramaamblycephala。后來，成慶泰等[2]將魴屬魚類劃分為3種，團(tuán)頭魴、魴和廣東魴。羅云林[45]基于魴屬魚類分類的已有研究，將魴屬修訂為4種，三角魴、團(tuán)頭魴、魴和厚頜魴。現(xiàn)在普遍認(rèn)為魴屬魚類為4個種[46]，分別是三角魴、團(tuán)頭魴、廣東魴和厚頜魴，其中三角魴為羅云林[45]所指的魴，廣東魴則為羅云林[45]所指的三角魴，團(tuán)頭魴、厚頜魴與羅云林[45]的分類相同?；诰€粒體基因組的BLAST、遺傳距離和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，賴瑞芳等[4]文中所稱的廣東魴(文中用拉丁名Megalobramaskolkovii表示，GenBank號為JX242528)應(yīng)該是現(xiàn)在普遍認(rèn)為的珠江流域三角魴，三角魴(文中用拉丁名Megalobramaterminalis表示，GenBank號為JX242530)應(yīng)該是現(xiàn)在普遍認(rèn)為的廣東魴。通過不同流域三角魴線粒體基因組比較來看，錢塘江流域三角魴在親緣關(guān)系上與珠江流域三角魴較近，而與黑龍江流域三角魴較遠(yuǎn)。這在一定程度上也反映出，地理位置的遠(yuǎn)近與親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近有一定相關(guān)性。基于線粒體基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹分析上的鳊屬、魴屬魚類親緣關(guān)系比較發(fā)現(xiàn)，長春鳊與魴屬魚類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但與基于形態(tài)分析上的親緣關(guān)系比較稍有出入[47]。這可能是因?yàn)榛谛螒B(tài)差異的系統(tǒng)進(jìn)化分析，受到干擾的因素較多，誤差較大；而基于堿基差異的系統(tǒng)進(jìn)化分析，由于堿基的保守性等原因，受到干擾的因素相對較小，因而結(jié)果相對準(zhǔn)確。基于線粒體基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹分析上的魴屬魚類的親緣關(guān)系分析結(jié)果，與其他學(xué)者基于線粒體基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹分析研究結(jié)果一致[4-5]，也與基于線粒體細(xì)胞色素b構(gòu)建的魴屬魚類親緣關(guān)系分析結(jié)果一致[46]，而與基于微衛(wèi)星構(gòu)建的魴屬魚類親緣關(guān)系分析結(jié)果則有所差別[48]。這種分析結(jié)果差異的產(chǎn)生可能是由于核基因組和線粒體基因組的差異性所造成。Hu等[5]基于線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹比較了黑龍江流域三角魴和錢塘江流域三角魴的親緣關(guān)系，與本研究結(jié)果一致，而本研究則基于賴瑞芳等[4]研究結(jié)果進(jìn)一步比較了錢塘江流域三角魴和黑龍江流域、珠江流域三角魴的親緣關(guān)系，補(bǔ)充了對三角魴不同地理群體間親緣關(guān)系的認(rèn)識。此外，基于同一群體的不同個體間，單核苷酸多態(tài)性是比較常見的。對不同年份保存的錢塘江三角魴樣品的BLAST分析表明，2個錢塘江三角魴線粒體基因組的單核苷酸差異位點(diǎn)有3個，分別位于NAD1，tRNA-Lys和NAD5基因中。

三角魴的自然分布，一般認(rèn)為是長江、黃河和黑龍江等水系[2]，珠江流域一般不存在自然分布，盡管有報道在珠江流域采集到了三角魴[4，47-48]，這些采集到的三角魴的原始種很可能來自于錢塘江水系或長江等其他水系。從基于線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果上看，珠江流域三角魴和錢塘江流域三角魴在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成分支的可靠性較低，SH-aLRT檢驗(yàn)值38.4%小于80%，ultrafast bootstrap校驗(yàn)值65%也小于95%[49]，這也表明珠江流域三角魴很可能與錢塘江流域三角魴屬于同一個進(jìn)化分支。此外，從基于線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果上還發(fā)現(xiàn)，在魴屬進(jìn)化分支中，厚頜魴處于錢塘江流域三角魴和黑龍江流域三角魴進(jìn)化分支之間，這與Hu等[5]的研究結(jié)果一致，究其原因還有待進(jìn)一步研究。