徐秀紅，劉金亮，李棟成，劉仁祥

(貴州大學(xué) 煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

煙草屬茄科草本植物，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在我國的種植面積廣泛。煙葉質(zhì)量直接影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而煙堿含量又與煙葉質(zhì)量密切相關(guān)，是影響煙葉質(zhì)量最重要的化學(xué)成分[1]。煙堿是煙草次生代謝的主要產(chǎn)物，煙堿含量的高低直接影響烤后煙葉的吸食品質(zhì)[2]。因此，煙堿是評(píng)價(jià)煙草和卷煙質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其合成代謝的途徑目前已有較多研究[3]。參與煙堿合成代謝途徑各個(gè)步驟的酶與編碼酶的基因基本都已被克隆[4-6]，其中腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)催化腐胺形成N-甲基腐胺，PMT控制著腐胺向煙堿合成方向的流動(dòng)速率，是煙堿合成代謝途徑中的限速酶[7-8]；喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPT)在吡啶類生物堿生物合成過程中控制煙酸的供應(yīng)[7-8]；類異黃酮還原酶基因A622可能參與煙酸與甲基吡咯啉陽離子的縮合反應(yīng)[6，9]。此外，還有一些轉(zhuǎn)化基因如CYP82E5V2、CYP82E2、CYP82E10和CYP82E4[6，10]，轉(zhuǎn)運(yùn)基因如MATE、JAT和NUP1[7]，調(diào)控因子如COI1和JAZ[7]，以及調(diào)控?zé)焿A合成的轉(zhuǎn)錄因子，如ERF轉(zhuǎn)錄因子家族[9，11]和bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族[12]，這些基因與煙堿含量密切相關(guān)。

不同煙草品種的遺傳特性不同，煙堿含量也存在差異。本文以烤煙K326、香料煙巴斯瑪、白肋煙TN90、晾煙馬里蘭煙為材料，選取成苗期、團(tuán)棵期、旺長期、打頂前后、成熟期的上、中、下部葉片，分析葉片煙堿含量變化，以及煙堿合成代謝途徑4個(gè)關(guān)鍵基因PMT、QPT、A622和CYP82E5V2的表達(dá)量，為解釋煙堿含量變化的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙K326、白肋煙TN90、香料煙巴斯瑪(Basma)、晾煙馬里蘭煙(Maryland)由貴州大學(xué)煙草學(xué)院提供。試驗(yàn)試劑有RNeasy Plant Mini Kit(74904)試劑盒(QIANEN公司)、DEPC水(華大基因)、隨機(jī)引物(Invitrogen)、RNA酶抑制劑(Invitrogen)、AMV(Invitrogen)、2×PCR MIX(QIAGEN)、TBE(華大基因)等。

1.2 方法

本研究于2016年5—9月在貴州大學(xué)磊莊基地(106°55′E、26°40′N)和貴州大學(xué)煙草學(xué)院(106°67′E、26°42′N)進(jìn)行。試驗(yàn)材料種植于磊莊基地，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每試驗(yàn)小區(qū)4行，每行15株，小區(qū)種植60株，行株距1.10 m×0.55 m，按常規(guī)管理措施進(jìn)行田間管理。

在不同發(fā)育時(shí)期(成苗期、團(tuán)棵期、旺長期、打頂前后、成熟期)對烤煙的不同部位葉片(上部葉片、中部葉片、下部葉片)進(jìn)行取樣，除苗期外，其他時(shí)期的葉片分上、中、下3個(gè)部位取樣。每3株樣品混合為1個(gè)樣本，分別用于RNA提取。同時(shí)對采收的鮮煙葉進(jìn)行殺青烘干制成煙葉樣品，用于煙堿含量測定。每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 煙堿含量

煙堿含量測定參照李春麗等[13]編著的《煙葉化學(xué)成分及分析》中的“紫外分光光度法”進(jìn)行。

1.3.2 RT-PCR分析

采用熒光定量PCR技術(shù)，用RNeasy Mini Kit(74904)試劑盒提取總RNA，按順序在1.5 mL離心管中加入DEPC水6 μL、RNA酶抑制劑(50 U·μL-1)0.5 μL、隨機(jī)引物(50 pmol·μL-1)2 μL、RNA 2 μL(體積10.5 μL)，在65 ℃水浴處理5 min，室溫放置10 min，高于8 000 ×g離心5 s，按順序在1.5 mL離心管中加入RNA酶抑制劑(50 U·μL-1)0.5 μL、5×buffer 4 μL、dNTP MIX(10 mmol·L-1)2 μL、ddH2O 2 μL、AMV(200 U·μL-1)1 μL(總體積20 μL)，40 ℃水浴反應(yīng)1 h，90 ℃處理5～10 min，水浴5 min，8 000×g離心5 s，把總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

在NCBI網(wǎng)站中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢并獲得所有相關(guān)基因的基因序列，并依據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物(表1)。采用Rapid SYBR?Green試劑在ABI ViiA 7PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)體系(16 μL)：上、下游引物(50 pmol·μL-1)各0.2 μL、H2O 6.6 μL、2×PCR MIX 8 μL，cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s， 72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)Ct值的采集采用校正的閾值設(shè)定，實(shí)時(shí)熒光定量PCR以actin作為內(nèi)參基因，以編號(hào)1的樣本作為對照組，采用2ΔΔCt法進(jìn)行相對定量計(jì)算。

表1 用于cDNA擴(kuò)增的PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers for cDNA amplification

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 19.0軟件、LSD法進(jìn)行3因素方差分析和相關(guān)性分析，用HEMI 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型煙草種質(zhì)的煙堿含量分析

在整個(gè)生育期，不同類型煙草種質(zhì)葉片中的煙堿含量為0.19%～3.73%(表2)，不同種質(zhì)之間的煙堿含量存在差異。總體上，烤煙K326的煙堿含量和香料煙巴斯瑪?shù)臒焿A含量相對較低，TN90和馬里蘭煙兩者的煙堿含量相對較高。在整個(gè)生育期，4個(gè)類型的煙草種質(zhì)煙堿含量變化規(guī)律也存在著差異。隨著生育期推進(jìn)，煙堿含量緩慢上升，打頂后急劇增加，除巴斯瑪打頂后還繼續(xù)上升外，K326、TN90和馬里蘭煙均表現(xiàn)為：打頂后煙堿含量先增加，后緩慢下降，再漸趨平穩(wěn)。

4個(gè)類型煙草上、中、下部葉片的煙堿含量隨生育期的變化趨勢基本一致。打頂前，除TN90無明顯規(guī)律外，K326、馬里蘭煙和巴斯瑪不同部位葉片煙堿含量基本表現(xiàn)為下部葉>中部葉>上部葉；打頂期，除TN90外，所有類型煙草各部位葉片的煙堿含量相當(dāng)；打頂后，不同類型煙草各部位葉片的煙堿含量變化不一致，馬里蘭煙各部位葉片的煙堿含量總體表現(xiàn)為上部葉=中部葉>下部葉(表2)。生育期、葉片部位、煙草種質(zhì)對煙堿含量的影響結(jié)果表明，生育期、煙草種質(zhì)對煙堿含量的影響達(dá)極顯著水平(P<0.01)，而葉片部位對煙堿含量影響不顯著(P>0.05)(表3)。

表2 四個(gè)類型煙草種質(zhì)不同生育期的煙堿含量Table 2 Nicotine content of four tobacco varieties leaves in different growth stages

2.2 煙堿合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

2.2.1PMT基因

由圖1可知，PMT基因在所有類型煙草的不同生育時(shí)期均有表達(dá)，除K326外，TN90、馬里蘭煙、巴斯瑪在苗期PMT基因表達(dá)量較高，除巴斯瑪打頂后表達(dá)量繼續(xù)上升外，其余類型均表現(xiàn)為打頂后表達(dá)量上升后再下降，后趨于穩(wěn)定。TN90、馬里蘭煙和巴斯瑪?shù)纳?、中、下部葉片PMT基因的表達(dá)量表現(xiàn)基本一致，而K326上部葉片PMT基因的表達(dá)量在打頂前后與中、下部葉片不同(圖1)。PMT基因相對表達(dá)量與煙堿含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，即該基因相對表達(dá)量越高，煙堿含量越高(表4)。生育期、不同部位、煙草品種對PMT基因的相對表達(dá)量影響均不顯著(P>0.05)，表明PMT基因的相對表達(dá)量受環(huán)境、種質(zhì)來源影響較小，表達(dá)量相對穩(wěn)定(表3)。

表3 生育期、葉片部位、煙草種質(zhì)對煙堿含量、PMT、QPT、CYP82E5V2和A622基因相對表達(dá)量的影響Table 3 Influence of growth stage， leaf location and tobacco germplasm on nicotine content and relative expression of PMT， QPT， CYP82E5V2 and A622 gene

2.2.2QPT基因

4個(gè)類型煙草種質(zhì)的QPT基因相對表達(dá)量變化較為一致，在整個(gè)生育期呈波浪狀起伏(圖2)。在生育前期，4個(gè)類型煙草種質(zhì)的QPT基因表達(dá)量均相對較高，除馬里蘭煙外，其余類型均在打頂前1周出現(xiàn)峰值，打頂后各類型煙草QPT表達(dá)量變化不一致。K326的QPT基因表達(dá)量在打頂后2周，上部葉和下部葉出現(xiàn)峰值后下降，而中部葉表達(dá)量持續(xù)上升。TN90上部葉和中部葉的QPT基因表達(dá)量在打頂后1周出現(xiàn)峰值，之后略有下降再繼續(xù)上升，下部葉的QPT基因表達(dá)量在打頂后持續(xù)上升。馬里蘭煙下部葉和中部葉的QPT基因表達(dá)量在打頂后2周出現(xiàn)峰值，然后下降，上部葉則先下降后上升。巴斯瑪在打頂后2周，上部葉和下部葉的QPT基因表達(dá)量出現(xiàn)峰值后下降，而中部葉的QPT基因表達(dá)量先下降后上升。QPT基因相對表達(dá)量受生育期、葉片部位影響，且分別達(dá)顯著(P<0.05)、極顯著水平(P<0.01)，煙草種質(zhì)對其影響不顯著(表3)。QPT基因的表達(dá)量與煙堿含量無顯著相關(guān)性(表4)。

SFS，成苗期；RS，團(tuán)棵期；VGS，旺長期；1-BT，打頂前1周；TS，打頂期；1-AT，打頂后1周；2-AT，打頂后2周；MS，成熟期。下同。SFS， Seedling formation stage; RS， Rosette stage; VGS， Vigorous growing stage; 1-BT， 1 week before topping; TS， Topping stage; 1-AT， 1 week after topping;2-AT， 2 weeks after topping; MS， Mature stage. The same as below.圖1 四種類型煙草不同生育時(shí)期PMT基因的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression level of PMT gene of four types of tobacco at different growth stages

圖2 四種類型煙草不同生育時(shí)期QPT基因的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression level of QPT gene of four types of tobacco at different growth stages

表4 煙堿合成代謝相關(guān)基因相對表達(dá)量與煙堿含量的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of nicotine content and relative expression of the genes related to nicotinic anabolism

2.2.3CYP82E5V2基因

4個(gè)類型煙草不同部位的CYP82E5V2相對表達(dá)量隨各自的生育期變化趨勢基本一致，僅K326上部葉片表達(dá)模式與其他不同(圖3)，K326的CYP82E5V2基因表達(dá)量則在打頂前1周和打頂后2周達(dá)到峰值，說明打頂處理對CYP82E5V2的相對表達(dá)量產(chǎn)生了影響。生長發(fā)育時(shí)期、煙草種質(zhì)對CYP82E5V2相對表達(dá)量的影響分別達(dá)極顯著水平(P<0.01)、顯著水平(P<0.05)，而不同部位對CYP82E5V2相對表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)(表3)。其中，馬里蘭煙中CYP82E5V2相對表達(dá)量與K326差異未達(dá)顯著水平，均高于TN90、巴斯瑪?？傮w上，CYP82E5V2相對表達(dá)量在不同類型煙草種質(zhì)的表現(xiàn)為K326>馬里蘭煙>TN90>巴斯瑪，且CYP82E5V2相對表達(dá)量與煙堿含量呈極顯著正相關(guān)(表4)。

圖3 四種類型煙草不同生育時(shí)期CYP82E5V2基因的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of CYP82E5V2 gene of four types of tobacco at different growth stages

2.2.4A622基因

K326、TN90和馬里蘭煙的A622不同生育期相對表達(dá)量表現(xiàn)為波浪狀起伏；而巴斯瑪?shù)腁622表達(dá)量隨生育期呈波浪狀上升(圖4)，在生長中前期(打頂前)相對較低，打頂后至成熟期后逐漸升高，特別是打頂后變化明顯，表明打頂處理對A622的相對表達(dá)量影響顯著。生育期、煙草品種對A622表達(dá)量的影響達(dá)極顯著水平(P<0.01)，煙草種質(zhì)對A622相對表達(dá)量的影響達(dá)顯著水平(P<0.05)(表3)。A622表達(dá)規(guī)律與煙堿含量變化規(guī)律基本一致，其表達(dá)量與煙堿含量呈顯著正相關(guān)的關(guān)系，即該基因相對表達(dá)量越高，煙堿含量越高(表4)。

圖4 四種類型煙草不同生育時(shí)期A622基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression level of A622 gene of four types of tobacco at different growth stages

3 結(jié)論與討論

生物堿是煙草中最重要的一類化學(xué)成分，生物堿的含量和比例決定煙葉感官品質(zhì)與安全性。煙堿占煙草生物堿總含量的90%～95%，占煙葉干重的0.6%～3.0%，是評(píng)價(jià)煙草和卷煙質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。煙堿含量的高低直接影響烤后煙葉的吸食品質(zhì)，過高會(huì)導(dǎo)致煙葉勁頭偏大，刺激性變強(qiáng)，協(xié)調(diào)性變差。煙堿含量受很多因素影響，除農(nóng)藝栽培措施[14]、外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[15]、土壤和氣候環(huán)境條件[16]等因素外，煙草自身的遺傳特性對其影響較大。本研究中的白肋煙TN90與曬晾煙馬里蘭煙種質(zhì)來源接近，兩者煙堿含量也接近，均高于烤煙K326和香料煙巴斯瑪，也說明了這一點(diǎn)。煙堿含量從成苗期到成熟期間的變化較大，K326、TN90在打頂前1周和打頂后1周煙堿含量處于較高水平，巴期瑪則持續(xù)增加，在成熟期達(dá)到頂點(diǎn)，且不同部位葉片煙堿變化趨勢基本一致。

4個(gè)煙堿合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量受煙草類型、發(fā)育時(shí)期、表達(dá)部位的影響不盡相同。PMT基因在整個(gè)生育期的相對表達(dá)量較為穩(wěn)定，受煙草類型、表達(dá)部位、發(fā)育時(shí)期的影響較小；QPT基因的相對表達(dá)量受發(fā)育時(shí)期、表達(dá)部位影響顯著，CYP82E5V2相對表達(dá)量受生育期、煙草類型影響顯著；A622的相對表達(dá)量受煙草種質(zhì)類型、生育期和表達(dá)部位的影響顯著。

煙堿的吡啶環(huán)部分由煙酸提供。在煙酸的生物合成途徑中，QPT的作用是催化喹啉酸形成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，因此QPT與煙堿的合成有較為直接的關(guān)聯(lián)。本次研究中，煙堿含量變化與QPT基因表達(dá)量的相關(guān)性不顯著，這表明QPT在煙堿生物合成過程中僅為煙酸的限速酶，其表達(dá)量的高低不能直接決定煙堿的合成量，其具體作用有待進(jìn)一步研究。由于PMT是煙堿合成的關(guān)鍵酶[17-18]，因此PMT基因表達(dá)量的高低直接決定了煙堿含量的高低。本研究結(jié)果也顯示，煙堿含量與PMT基因的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。需要注意的是，從煙草類型、生育期、表達(dá)部位看，PMT基因的表達(dá)始終處于較為穩(wěn)定的水平，受上述3種因素的影響不顯著；因此，PMT基因參與煙堿合成的途徑與方式還需要深入研究。

不同類型煙草的煙堿含量差異明顯，PMT、QPT、CYP82E5V2、A622 4個(gè)煙堿合成代謝途徑的關(guān)鍵基因的相對表達(dá)量受煙草種質(zhì)類型、生育期、表達(dá)部位的影響不同，煙堿含量變化與CYP82E5V2、PMT、A622的相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與QPT基因的相對表達(dá)量相關(guān)性不顯著。本文煙草生長發(fā)育過程中的煙堿含量變化規(guī)律，可為生產(chǎn)上降低煙堿含量措施的選擇時(shí)期起到指導(dǎo)作用；而煙堿含量與相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果，可為從分子水平闡述煙堿合成代謝機(jī)理和生產(chǎn)上利用生物技術(shù)降低或提高煙草的煙堿含量提供一定的理論參考。