洪 霞，趙永彬，屈為棟，陳銀龍，邱莉萍，王嬌陽(yáng)

(臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臺(tái)州 317000)

芋，又稱芋頭、芋艿、毛芋，為天南星科芋屬植物，起源于中國(guó)、印度、馬來半島等地，在全世界廣泛栽培[1-2]。我國(guó)芋栽培利用已有2 000多年歷史，芋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含淀粉、多糖、氨基酸、維生素和多種礦物質(zhì)，其球莖、花、葉柄等部位主要作為蔬菜用。另外，芋還可以作為藥用，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為芋味辛甘，全株可入藥，具有補(bǔ)益脾胃、破血解散等功效，現(xiàn)在醫(yī)學(xué)則認(rèn)為芋在降血糖、抗腫瘤中能起到一定作用，其豐富的黏多糖還能提高機(jī)體免疫力[3-5]。世界范圍內(nèi)，芋的消費(fèi)量在蔬菜中排名14，在塊根作物中排名第5，被國(guó)際植物資源研究所列為“不被注意的重要植物”[6-7]，但是芋作為重要的蔬菜兼糧用特色作物，在促進(jìn)浙江省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增產(chǎn)增收中發(fā)揮著重要的作用。

芋主要分為魁芋、魁子兼用芋、多子芋和多頭芋，是種質(zhì)創(chuàng)新的重要基礎(chǔ)[8]。浙江省芋資源豐富，地方品種眾多，經(jīng)濟(jì)效益好，如奉化芋艿、仙居紅香芋、黃巖沙埠芋等在省內(nèi)外具有一定知名度，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民重要的經(jīng)濟(jì)來源[9-10]。浙江省栽培的芋品種主要為地方品種，一般經(jīng)過無(wú)性繁殖進(jìn)行保種種植，也有通過優(yōu)良變異單株進(jìn)行選育，如多子芋新品種金華紅芽芋[11]。在縉云、永康等地，農(nóng)技人員總結(jié)出適宜當(dāng)?shù)氐母咝г耘嗉夹g(shù)，促進(jìn)當(dāng)?shù)氐挠螽a(chǎn)業(yè)發(fā)展[12-13]。浙江省高度重視芋種質(zhì)資源保護(hù)工作，在種質(zhì)資源收集方面居于全國(guó)領(lǐng)先地位，但其遺傳多樣性分析相關(guān)的研究仍為空白，同名異種與異名同種現(xiàn)象并存，阻礙了芋資源評(píng)價(jià)、保護(hù)與利用創(chuàng)新。

形態(tài)學(xué)性狀和DNA分子標(biāo)記是研究芋遺傳多樣性和品種分類的主要方法。目前，形態(tài)學(xué)性狀仍是種質(zhì)資源研究的重要手段之一，在茶樹、棉花等遺傳多樣性分析上均有較好應(yīng)用[14-16]。近年來DNA分子標(biāo)記開始應(yīng)用到芋種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。沈鏑等[17]利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分子標(biāo)記將云南的28份芋資源分成2個(gè)類群，一類為葉柄或芋梗食用芋，另一類多為子芋、母芋食用芋。利用武漢國(guó)家芋資源種質(zhì)資源圃的芋種質(zhì)，董紅霞等[18]使用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)分子標(biāo)記將72份芋資源在相似系數(shù)0.725處分為3大類，第一類有30份資源，主要為白芽綠柄多子芋；第二類共22份資源，紅紫柄多子芋最多，為9份；第三類20份資源中淡紅芽烏綠柄多子芋較多，為7份。此外，You等[19]還利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法開發(fā)了新的芋資源表達(dá)序列標(biāo)簽-微衛(wèi)星(EST-SSR)標(biāo)記，豐富了芋的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記。在不同的分子標(biāo)記應(yīng)用中，SSR標(biāo)記的穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，在全基因組中分布廣泛，也是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部用于種質(zhì)純度鑒定的分子標(biāo)記[20]。本研究選取25份浙江省地方特色芋種資源，依據(jù)芋種質(zhì)資源描述規(guī)范考察生物學(xué)性狀，對(duì)15個(gè)表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析、主成分分析，并開展形態(tài)性狀標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記相結(jié)合的聚類分析，旨在揭示地方品種之間的親緣關(guān)系，挖掘特異芋種質(zhì)，為芋種質(zhì)利用創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取的25份特色芋種質(zhì)材料來源于浙江省芋種質(zhì)資源圃，主要從浙江省各個(gè)市縣區(qū)的鄉(xiāng)鎮(zhèn)、村等收集而來，為不同的地方芋[C.esculenta(L.) Schott]品種，詳見表1。試驗(yàn)所用的20條SSR引物從已經(jīng)發(fā)表的芋89對(duì)SSR引物篩選得到，引物由北京鼎國(guó)生物科技公司合成[19，21-22]。dNTPs、Easytaq?DNA polymerase for PAGE等試劑均來自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司。用于丙烯酰胺凝膠電泳的AgNO3、NaOH等試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技公司。

表1 二十五份供試浙江芋種質(zhì)資源Table 1 25 taro germplasms from Zhejiang Province

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與性狀觀測(cè)

材料均種植于浙江省芋種質(zhì)資源圃，位于臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院臨海試驗(yàn)基地(121°14′ E， 28°83′ N)，2017—2018年連續(xù)2年試驗(yàn)，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，株距35 cm，行距65 cm，每份資源種植20株。在生長(zhǎng)中期(7—8月份)，每個(gè)品種資源隨機(jī)選擇5個(gè)植株調(diào)查地上部葉片、葉柄等各項(xiàng)性狀；在收獲期(10月)觀測(cè)地下部的子孫芋、母芋的性狀，并測(cè)定子孫芋總質(zhì)量與母芋質(zhì)量。所有性狀觀測(cè)按照芋種質(zhì)資源描述規(guī)范與數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[23]，其中表型性狀各項(xiàng)指標(biāo)與賦值見表2。

續(xù)表1 Continued Table 1

表2 表型性狀指標(biāo)與賦值標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Morphological traits and assignment criterion

1.2.2 DNA提取

取芋幼嫩葉片，使用CTAB法提取全基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠鑒定DNA的純度，使用Nanodrop測(cè)定核酸濃度，用滅菌去離子水將DNA稀釋至50 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增與SSR檢測(cè)

SSR-PCR總反應(yīng)體系為15 μL，其中10 × PCR buffer for page 1.5 μL、0.2 mmoL·L-1dNTPs 2 μL、0.5 μmoL·L-1的正反引物各0.5 μL、DNA 模板1 μL、1 UTaqDNA聚合酶0.2 μL。SSR擴(kuò)增在ABI Veriti PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55～58 ℃(每對(duì)引物的最適退火溫度)退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。SSR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳裝置為北京六一生物科技有限公司DYCZ-30C型，通過銀染、顯色并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)表型性狀的觀測(cè)進(jìn)行數(shù)量化賦值(表3)，接著進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)，以Shannon Wiener指數(shù)H′表示。H′=-∑(Pi)(lnPi)，其中Pi為第i種樣品在群體中的頻率。通過計(jì)算子孫芋總質(zhì)量與母芋質(zhì)量的比值，將芋資源分為魁芋(小于1)、魁子兼用芋(等于1)、多子芋(大于1)等類型。采用SPSS 20.0對(duì)表型性狀進(jìn)行主成分分析，使用NTSYS-pc Ver. 2. 10軟件進(jìn)行聚類，函數(shù)選用EUCLID。

每個(gè)SSR位點(diǎn)條帶清晰且在電泳遷移同一位置重復(fù)出現(xiàn)的記作1，沒有條帶記作0，條帶不確定的記為2，構(gòu)建excel 0、1矩陣。統(tǒng)計(jì)每個(gè)SSR引物的等位變異位點(diǎn)數(shù)和總等位變異位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算多態(tài)信息含量PIC(polymorphism information content)值。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入NTSYS-pc Ver. 2. 10軟件進(jìn)行分析，先用DICE方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)(genetic similarity，GS)，接著使用SHAN程序按照非加權(quán)配對(duì)法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芋種質(zhì)資源表型性狀多樣性

芋的葉形、葉柄顏色、母芋的芽色、子孫芋質(zhì)量占比等一直是芋園藝學(xué)分類的重要依據(jù)。如表3所示，芋表型性狀的變異系數(shù)為0～56.98%，平均為31.32%。其中，母芋表皮顏色變異系數(shù)最大，為56.98%；其次為母芋的芽色與葉心色斑顏色，分別為55.56%與47.79%(表3)。在25份芋資源中，母芋肉顏色是沒有變異的，全部為白色。15個(gè)性狀的遺傳多樣性指數(shù)為0～1.95，多樣性指數(shù)均值為0.97，其中葉柄中下部顏色的遺傳多樣性指數(shù)最大，為1.95，其次是母芋芽色和子芋形狀，分別為1.54和1.38，隨后分別是葉心色斑類型和葉形。芋收獲后，子孫芋總質(zhì)量與母芋質(zhì)量的比值變異范圍為0.82～3.96，25份芋資源中，魁芋4份，魁子兼用芋1份，多子芋為20份(表1)。

表3 表型性狀統(tǒng)計(jì)分析與多樣性指數(shù)Table 3 Statistic analysis and diversity index of phenotype

2.2 芋種質(zhì)資源的表型性狀主成分分析

對(duì)25種芋資源具有不同程度變異的14個(gè)表型性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，前5個(gè)主成分對(duì)總變異的累計(jì)貢獻(xiàn)率總計(jì)達(dá)77.649%，特征值總和為10.871，可反映大部分表型指標(biāo)(表4)。其中，主成分1特征值為3.618，貢獻(xiàn)率為25.846%，特征向量值比較高且為正值的有子芋形狀、孫芋形狀、葉尖、葉形、葉基，分別為0.487、0.419、0.335、0.310、0.209，這些形狀變異指標(biāo)可反映多子芋品種形狀綜合因子。特征向量值為負(fù)值的農(nóng)藝性狀有母芋表皮顏色、母芋芽色與母芋形狀，說明在多子芋品種選育中母芋性狀具有一定的選擇性。主成分2特征值為2.777，貢獻(xiàn)率為19.833%，主要體現(xiàn)母芋芽色、葉心色斑類型、葉形、葉心色斑顏色、葉尖、葉基等變異，反映葉片形狀綜合因子。主成分3特征值1.869，貢獻(xiàn)率為13.349%，主要反映葉心色斑顏色、母芋形狀、母芋肉纖維顏色、葉柄中下部顏色的變異，這4個(gè)形態(tài)標(biāo)記的特征向量均為正值，為0.384～0.486，主要反映母芋株型性狀因子。主成分4的特征值為1.522，貢獻(xiàn)率為10.874%，以母芋表皮棕毛類型特征向量最大，為0.650。主成分5的特征值為1.085，貢獻(xiàn)率為7.747%，主要表征母芋表皮顏色、葉形、母芋芽色、母芋肉纖維顏色等的變異。

表4 各表型5個(gè)主成分的特征向量與貢獻(xiàn)率Table 4 Egienvalue and contribution rate of the 5 principal component factors of each phenotype

2.3 芋種質(zhì)資源表型性狀的聚類分析結(jié)果

EUCLID聚類結(jié)果顯示，在遺傳距離4.171處可以將25份芋資源分成5個(gè)類別(圖1)。第Ⅰ類包括了6份資源，其中有1份魁芋，5份多子芋；葉為箭形或卵形，葉心無(wú)色斑或?yàn)閿U(kuò)展?fàn)?；?號(hào)車梢芋葉柄中下部顏色為深綠，其余均為綠色；在母芋芽色方面，10號(hào)麗水芋頭為紫紅芽，其余為淡紅芽；子孫芋的形狀以棒槌形與長(zhǎng)卵形為主，母芋形狀主要為圓柱形。第Ⅱ類僅有3號(hào)香蕉芋，為深綠柄白芽魁芋。第Ⅲ類由2份紫紅柄魁芋(1份白芽，1份黃白芽)與4份紫黑柄多子芋(1份黃白芽，3份白芽)組成；葉形為箭形或卵形，葉尖多鈍，葉心無(wú)色斑或?yàn)榘唿c(diǎn)，以紫紅色為主；子孫芋形狀全為卵圓形，母芋形狀為圓柱形，芽色偏白。第Ⅳ類有10份資源，16號(hào)為魁子兼用芋，其余9份為多子芋；葉柄中下部為綠色，深綠色或?yàn)蹙G色；子孫芋形狀為倒圓錐或卵圓，母芋形狀為圓球形或圓柱形；芽色有白芽(7份)、黃白芽(1份)或淡紅芽(2份)。第Ⅴ類為5號(hào)烏紫芋與22號(hào)土紫芋，它們均為紫黑柄多子芋，子孫芋形狀卵圓，母芋芽白，呈圓柱形。

2.4 芋種質(zhì)資源的SSR分子標(biāo)記聚類分析結(jié)果

從已經(jīng)發(fā)表的89對(duì)引物中篩選獲得20對(duì)條帶清晰，多態(tài)性高的SSR引物[19，21-22]。20對(duì)引物在25份芋資源中擴(kuò)增共獲得53個(gè)條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為2.65個(gè)。具有多態(tài)性的條帶有48條，平均多態(tài)性比率為90.6%，PIC值為0.22～0.64，表明芋種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性。圖2為SSR引物CE11在25份芋資源中的擴(kuò)增圖，擴(kuò)增條帶為100～200 bp。

通過NTSYS-pc Ver. 2.10軟件對(duì)不同芋種質(zhì)資源進(jìn)行分子標(biāo)記聚類分析，結(jié)果顯示，DICE遺傳相似系數(shù)平均值為0.665。其中，6號(hào)寧波白芋與12號(hào)衢州芋艿的相似系數(shù)最大，通過SSR標(biāo)記未能區(qū)分這2份資源；相似系數(shù)最小的是11號(hào)寧波紅芋(多子芋)與24號(hào)金華水芋(魁芋)，為0.357。在遺傳相似系數(shù)0.721處，25份芋可以分為5個(gè)類別。第Ⅰ類為1號(hào)仙居紅芋與10號(hào)麗水芋頭，位于表型性狀聚類的第Ⅰ類。第Ⅱ類有7份資源，在表型性狀聚類的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類別中均有分布，由3份魁芋(2份白芽，1份淡紅芽)，1份魁子兼用芋(白芽)和3份多子芋(淡紅芽)組成。第Ⅲ類由7號(hào)寧波車梢芋(淡紅芽)與24號(hào)金華水芋(黃白芽)組成，分別處于表型性狀聚類的第Ⅰ類與第Ⅲ類。第Ⅳ類別共有9份多子芋(6份白芽，2份黃白芽，1份淡紅芽)，包含了表型分類第Ⅴ類別的2份資源，其余7份在表型性狀聚類的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ類中均有分布，其中位于表型性狀聚類的Ⅲ類中有4份，Ⅳ類中2份。第Ⅴ類別共有5份多子芋(白芽)，被包含在表型性狀聚類的第Ⅳ類中。由此可以看出，SSR分子標(biāo)記的聚類結(jié)果與表型標(biāo)記的聚類結(jié)果有一定的聯(lián)系，卻又有所不同。

編號(hào)1～25同表1。下同。No. 1-25 were the same as Table 1.The same as below.圖1 基于表型的芋種質(zhì)資源聚類分析結(jié)果Fig.1 Clustered results of Colocasia esculenta germplasm based on their phenotype

M，100 bp ladder Ⅰ(鼎國(guó))。M， 100 bp ladder Ⅰ(Dingguo).圖2 SSR引物CE11在25個(gè)芋資源中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of SSR primer CE11 in 25 taro germplasms

圖3 基于SSR分子標(biāo)記的芋種質(zhì)資源聚類Fig.3 Clustered results of Colocasia esculenta germplasms based on SSR Markers

3 結(jié)論與討論

3.1 芋種質(zhì)資源表型性狀的遺傳多樣性

芋生物學(xué)性狀的變異能夠反映這個(gè)群體的遺傳多樣性，體現(xiàn)資源的豐富程度，是種質(zhì)資源分類鑒定的依據(jù)之一。前人研究芋表型性狀之間的聯(lián)系，如多子芋葉柄顏色、芽色、芋形狀之間的關(guān)系，但特定群體表型遺傳多樣性相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析未見相關(guān)報(bào)道[24]。本研究基于浙江省地方特色種質(zhì)群體的表型性狀分析，得到變異系數(shù)與多樣性指數(shù)均值分別為31.32%與0.97。15個(gè)表型性狀中，除了母芋肉顏色為穩(wěn)定遺傳，其余14個(gè)性狀均出現(xiàn)不同程度的變異。在20份多子芋中，14份子孫芋形狀為卵圓形，占比較高，說明生產(chǎn)中地方種植的這種類型品種較多，這可能與其商品性好密切相關(guān)，卵圓形性狀也可作為優(yōu)異芋種質(zhì)判定指標(biāo)之一，這與黃新芳等[25]的研究結(jié)果相一致。25份資源中，挖掘出2份特異芋種質(zhì)，分別為9號(hào)臺(tái)州黃巖水芋(白芽)與24號(hào)金華浦江水芋(黃白芽)，它們均為魁芋，葉柄中下部為紫紅色。

通過對(duì)25份不同來源的芋種質(zhì)資源進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示，前5個(gè)主成分反映了14個(gè)性狀的全部信息，累計(jì)貢獻(xiàn)率為77.649%，累積特征值為10.871，反映了芋種質(zhì)的大部分特征，并且不同主成分反映的表型性狀差異較大。貢獻(xiàn)率較大的指標(biāo)為子孫芋形狀、母芋芽色、葉心色斑顏色、葉柄中下部顏色、母芋表皮棕毛等，這些是造成芋種質(zhì)表型差異的主要指標(biāo)，可作為芋資源的鑒別指標(biāo)。另外，品種資源和性狀指標(biāo)的選擇相關(guān)聯(lián)，多子芋型品種選育應(yīng)注重第一主成分選擇，母芋型品種則注重第三成分的選擇。上述研究表明，浙江省地方芋品種群體資源的變異較為豐富。

3.2 表型性狀聚類與SSR分子標(biāo)記聚類的比較

為揭示不同芋資源之間的親緣關(guān)系，本研究分別采取了表型性狀與SSR分子標(biāo)記對(duì)25份浙江省芋種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，分子標(biāo)記聚類的Ⅰ類包含于表型性狀聚類的Ⅰ類之中，而表型性狀聚類的Ⅰ類還包含了分子標(biāo)記聚類Ⅱ類的4號(hào)與20號(hào)資源，Ⅲ類中的7號(hào)資源與Ⅳ類中的8號(hào)資源；表型性狀聚類的第Ⅱ類位于分子標(biāo)記的Ⅱ類中，第Ⅲ類中有4份位于分子標(biāo)記聚類的Ⅳ類中，另外2份分別位于Ⅱ類與Ⅲ類；表型性狀聚類的第Ⅳ類包含了分子標(biāo)記聚類第Ⅴ類所有資源，以及第Ⅱ類中3份資源與第Ⅳ類中的2份資源；分子標(biāo)記聚類的第Ⅳ類還包含了表型性狀聚類的第Ⅴ類資源。由此可見，表型性狀聚類與分子標(biāo)記聚類兩者具有一定的聯(lián)系，但又有所不同。趙文杰等[26]在甜高粱的聚類分析中也獲得了類似結(jié)論。這可能是由于兩者聚類的理論基礎(chǔ)不一樣，SSR標(biāo)記是基于芋的基因序列的差異，而表型標(biāo)記是基因跟環(huán)境共同作用的結(jié)果。在本研究中，不論是表型性狀聚類還是分子標(biāo)記聚類，不同芋資源之間的親緣關(guān)系與地理來源并沒有明確關(guān)系，與前人的研究具有一致性[27]。如1號(hào)仙居紅芋與10號(hào)麗水蓮都芋頭親緣關(guān)系較近，但地理位置較遠(yuǎn)；而6號(hào)白芋與7號(hào)車梢芋都來自寧波高堂島鄉(xiāng)，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

在芋種質(zhì)資源的遺傳多樣性方面，國(guó)內(nèi)已有研究基于云南、四川、國(guó)家武漢芋種質(zhì)資源圃等的芋資源，RAPD、ISSR、SSR、SRAP等分子標(biāo)記聚類分析均有報(bào)道[17-19，27-29]。浙江省芋種植范圍廣，地方品種眾多，全省各縣市區(qū)均有分布，是重要的蔬菜兼糧用作物，這些地方品種之間的親緣關(guān)系首次得到深入分析。通過表型性狀聚類與分子標(biāo)記聚類的比較，在表型性狀聚類中可以看到第Ⅲ類別中15號(hào)、18號(hào)、23號(hào)這3份資源未能區(qū)分，而使用SSR分子標(biāo)記則能較好地將其分開；在SSR分子標(biāo)記聚類中，6號(hào)與12號(hào)相似系數(shù)達(dá)1，通過表型性狀聚類則能很好地鑒別。本研究基于浙江省特色地方芋小種進(jìn)行表型性狀與分子標(biāo)記2種方式的聚類，在芋資源遺傳多樣性研究中屬首次，更好揭示了芋資源地方小種的親緣關(guān)系，也直觀地表明了生物學(xué)性狀與分子標(biāo)記在種質(zhì)資源的鑒別方面具有很好的互補(bǔ)作用。此外，本研究還挖掘出2份特異芋種質(zhì)，表明浙江省芋種質(zhì)資源豐富的遺傳多樣性，這將為芋種質(zhì)資源的進(jìn)一步保護(hù)、利用與創(chuàng)新提供重要的理論依據(jù)。