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        基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的別構(gòu)分子理性設(shè)計(jì)研究
        ——北京大學(xué)分子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室近年研究進(jìn)展

        2020-10-13 13:41:30劉培王立銘劉瑩來魯華
        藥學(xué)進(jìn)展 2020年8期
        關(guān)鍵詞:激活劑口袋位點(diǎn)

        劉培,王立銘,劉瑩,2*,來魯華,2,3**

        (1.北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 分子動(dòng)態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京分子科學(xué)國家研究中心,北京 100871;2. 北京大學(xué)定量生物學(xué)中心,北京 100871;3. 北京大學(xué)-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心,北京 100871)

        別構(gòu)(又稱“變構(gòu)”)調(diào)控(allosteric regulation)是指效應(yīng)分子結(jié)合在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上不同于底物位點(diǎn)的別構(gòu)位點(diǎn)(allosteric site),通過多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性改變的過程[1]。作為一種細(xì)胞內(nèi)有效的調(diào)控蛋白質(zhì)功能的方式,別構(gòu)調(diào)控在很多的生物過程中發(fā)揮著重要作用,包括酶催化[2]、信號(hào)傳導(dǎo)[3]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]、代謝調(diào)控[5]、協(xié)同進(jìn)化[6]等。自50多年前提出別構(gòu)效應(yīng)以來,除了別構(gòu)調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制尚未研究清楚,別構(gòu)概念、實(shí)驗(yàn)和理論研究[7-8]都有很大進(jìn)展。

        別構(gòu)調(diào)控在蛋白質(zhì)中廣泛存在,因此針對(duì)別構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)為控制蛋白質(zhì)活性提供了另外一條途徑。藥物根據(jù)其作用機(jī)制可以分為正構(gòu)藥物(orthosteric drug)和別構(gòu)藥物(allosteric drug)。正構(gòu)藥物結(jié)合在蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn),占據(jù)底物或輔基的結(jié)合位點(diǎn),通過阻礙底物或者輔基與蛋白質(zhì)的結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)的活性;別構(gòu)藥物則通過結(jié)合在非活性位點(diǎn)來改變或者阻斷催化或者底物的結(jié)合來發(fā)揮作用。目前除了在美國上市的18種別構(gòu)調(diào)控劑,大部分已上市藥物為正構(gòu)藥物。相對(duì)于正構(gòu)藥物,別構(gòu)藥物有著如下優(yōu)勢(shì):1)選擇性高。正構(gòu)位點(diǎn)藥物,由于其同家族蛋白活性位點(diǎn)的保守性,存在選擇性的問題;別構(gòu)藥物則由于結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)保守性低,因而副作用更小。2)別構(gòu)藥物和底物可以同時(shí)發(fā)揮作用,其調(diào)控功能具有上限性,毒性小。3)別構(gòu)位點(diǎn)提供了新的結(jié)合位點(diǎn)。從功能上講,別構(gòu)藥物既可以下調(diào)蛋白的活性成為抑制劑,也可以上調(diào)蛋白活性成為激活劑。目前已有多種針對(duì)不同靶標(biāo)的別構(gòu)調(diào)控分子被發(fā)現(xiàn),包括G蛋白偶聯(lián)受體、離子通道、酶以及其他的靶標(biāo),然而大部分別構(gòu)調(diào)控分子還是通過高通量實(shí)驗(yàn)篩選獲得[9],別構(gòu)調(diào)控分子的理性設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)仍頗具挑戰(zhàn)性。

        近年來有關(guān)別構(gòu)調(diào)控分子的理性設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)取得了令人鼓舞的成果,詳見近期綜述[1,7,10-12]。筆者實(shí)驗(yàn)室對(duì)于別構(gòu)調(diào)控的研究源于對(duì)于人類花生四烯酸(AA)代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的研究,為了有效控制炎性分子的產(chǎn)生,需要上調(diào)網(wǎng)絡(luò)中的一些靶標(biāo),而酶的激活只能通過別構(gòu)調(diào)控來實(shí)現(xiàn)[13-14],筆者實(shí)驗(yàn)室發(fā)展了別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法和別構(gòu)調(diào)控分子的理性設(shè)計(jì)方法,并在一些重要靶標(biāo)上獲得了上調(diào)的別構(gòu)分子。本文將主要介紹別構(gòu)位點(diǎn)的預(yù)測(cè)與確認(rèn),以及別構(gòu)調(diào)控分子的發(fā)現(xiàn)實(shí)例。

        1 基于理論計(jì)算的別構(gòu)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)

        理性設(shè)計(jì)別構(gòu)調(diào)控分子,首先需要尋找靶標(biāo)的別構(gòu)位點(diǎn)(見圖1)。雖然原則上所有的蛋白質(zhì)都是別構(gòu)的[15],但是被實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的別構(gòu)位點(diǎn)數(shù)量有限,目前最大的別構(gòu)蛋白數(shù)據(jù)庫(allosteric database,ASD)也只收錄了1 949個(gè)蛋白質(zhì)[10]。近十幾年來,很多研究者也一直在關(guān)注如何發(fā)現(xiàn)潛在的別構(gòu)口袋。發(fā)現(xiàn)別構(gòu)口袋的方法可以分為實(shí)驗(yàn)(包括高通量篩選、點(diǎn)突變、核磁馳豫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和氘氫交換質(zhì)譜等)和理論計(jì)算兩大類[7,16]。單純開展實(shí)驗(yàn)工作的研究,一方面工作量很大,另一方面實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有偶然性;而理論計(jì)算方法在降低成本的同時(shí)可以大幅提高別構(gòu)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的成功率,有利于別構(gòu)抑制劑的機(jī)制的探究,因此,需要發(fā)展基于理論計(jì)算的別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法。

        圖 1 理性設(shè)計(jì)別構(gòu)調(diào)控分子的流程Figure 1 Workflow of rational design of allosteric modulators

        當(dāng)已知蛋白質(zhì)活性和非活性2種狀態(tài)的結(jié)構(gòu)時(shí),可以根據(jù)這2種結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變情況進(jìn)行別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)。Qi等[17]和Ma等[18]發(fā)展了利用粗?;B(tài)Gō模型預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的方法。首先用二態(tài)Gō產(chǎn)生蛋白質(zhì)活性構(gòu)象和非活性構(gòu)象的平衡系綜,然后在探測(cè)到的蛋白質(zhì)表面可成藥結(jié)合位點(diǎn)(非活性位點(diǎn))內(nèi),用微擾的方法改變殘基之間的相互作用模擬小分子的結(jié)合過程。若微擾的施加導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象系綜發(fā)生變化,那么此微擾施加的位點(diǎn)便可能是一個(gè)潛在的別構(gòu)位點(diǎn)。利用這種方法,結(jié)合筆者實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的口袋探測(cè)程序CAVITY[19-20],成功發(fā)現(xiàn)了大腸埃希菌中D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(E.coli D-3-phosphoglycerate dehydrogenase,PGDH)的新的別構(gòu)位點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上經(jīng)計(jì)算虛擬篩選和實(shí)驗(yàn)獲得了別構(gòu)抑制劑[17,21]。這種預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的方法需要已知所研究蛋白質(zhì)的2種構(gòu)象及活性有差別的狀態(tài),故其應(yīng)用范圍有局限性。

        大多數(shù)情況下并不知道所研究的蛋白質(zhì)是否會(huì)被別構(gòu)調(diào)控,更沒有調(diào)控后的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可用。針對(duì)這種情況,Ma等[22]假設(shè)蛋白質(zhì)正構(gòu)位點(diǎn)和別構(gòu)位點(diǎn)運(yùn)動(dòng)上的強(qiáng)相關(guān)性是一種普遍存在的現(xiàn)象,可用于別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè),并采用粗?;母咚咕W(wǎng)絡(luò)模型對(duì)這種相關(guān)性進(jìn)行了研究。他們?cè)跍y(cè)試23個(gè)聚集狀態(tài)為單體的別構(gòu)蛋白質(zhì)的24個(gè)已知?jiǎng)e構(gòu)口袋后發(fā)現(xiàn),其中23個(gè)已知?jiǎng)e構(gòu)口袋與其對(duì)應(yīng)的正構(gòu)口袋在運(yùn)動(dòng)上顯示了強(qiáng)相關(guān)性。隨后他們又分析了幾種多聚體別構(gòu)蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)其正構(gòu)口袋與別構(gòu)口袋也有很強(qiáng)的相關(guān)性。并且這種結(jié)果不依賴于蛋白質(zhì)的初始結(jié)構(gòu),具有魯棒性?;谶@些結(jié)果開發(fā)了一種在已知一種蛋白質(zhì)構(gòu)象的情況下,可以快速預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的理論計(jì)算方法和程序CorrSite。

        為方便用戶使用,以上的程序CAVITY和CorrSite已集成在CavityPlus上[23]。CavityPlus是一個(gè)Web在線計(jì)算平臺(tái),使用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息作為輸入,提供蛋白質(zhì)口袋檢測(cè)和各種功能分析。該平臺(tái)應(yīng)用CAVITY來檢測(cè)給定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面上的潛在結(jié)合位點(diǎn),并根據(jù)配體性和可成藥性評(píng)分對(duì)其進(jìn)行排名??梢允褂?個(gè)子模塊CavPharmer[24]、CorrSite[22]和CovCys[25]進(jìn)一步分析這些潛在的結(jié)合位點(diǎn):CavPharmer使用基于受體的藥效團(tuán)建模程序Pocket以自動(dòng)提取口袋內(nèi)的藥效團(tuán)特征;CorrSite可以識(shí)別潛在的別構(gòu)配體結(jié)合位點(diǎn);CovCys則能自動(dòng)檢測(cè)可藥用的半胱氨酸殘基,可在設(shè)計(jì)共價(jià)別構(gòu)分子時(shí)用于尋找合適的共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。

        其他研究團(tuán)隊(duì)也通過不同計(jì)算策略開發(fā)出多種類型的別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法[26-31]。在這些預(yù)測(cè)方法中,筆者實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的CorrSite表現(xiàn)出其優(yōu)越性:與基于二態(tài)Gō模型預(yù)測(cè)別構(gòu)口袋的方法相比[17],CorrSite只需蛋白質(zhì)任意一種活性狀態(tài)的結(jié)構(gòu)即可,使用范圍更廣;與利用分子動(dòng)力學(xué)(molecular dynamics,MD) 模擬來預(yù)測(cè)別構(gòu)口袋的方法相比[26-27],CorrSite耗時(shí)很短,使用方便;與僅基于結(jié)構(gòu)的方法相比[28],CorrSite考慮到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中各個(gè)部分的相互作用;與同樣使用正則模式分析(normal mode analysis,NMA)來鑒定蛋白質(zhì)別構(gòu)位點(diǎn)的PARS(Protein Allosteric and Regulatory Sites)方法相比[29],CorrSite的算法更為簡單,正確率也更高[22]。不過,受限于當(dāng)時(shí)可用的蛋白數(shù)量以及計(jì)算量,CorrSite存在一定的局限性,這也是進(jìn)行別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)研究遇到的共性的問題。隨著已知?jiǎng)e構(gòu)蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)數(shù)量的增加,CorrSite可以在更大的數(shù)據(jù)集上進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。

        目前,基于蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的別構(gòu)位點(diǎn)研究受到很多關(guān)注,例如結(jié)合口袋特征及NMA分析進(jìn)行蛋白質(zhì)別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)的方法AllositePro表現(xiàn)出較好的預(yù)測(cè)效果[32];Yu 等[30]研究了計(jì)算原子運(yùn)動(dòng)相關(guān)性時(shí)的角度問題;Zhang等[31]在2019年發(fā)表的一篇綜述中提出蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中利用蛋白質(zhì)內(nèi)在動(dòng)力學(xué)來調(diào)控別構(gòu)與正構(gòu)功能?;诘鞍踪|(zhì)動(dòng)力學(xué)相關(guān)性的別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法,在多個(gè)體系的別構(gòu)調(diào)控分子設(shè)計(jì)中得到了成功應(yīng)用。

        2 別構(gòu)調(diào)控分子的理性設(shè)計(jì)實(shí)例

        在找到靶標(biāo)的別構(gòu)位點(diǎn)之后,通過計(jì)算與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法有望發(fā)現(xiàn)別構(gòu)調(diào)控分子。下面介紹筆者實(shí)驗(yàn)室近年的研究進(jìn)展。

        2.1 別構(gòu)激活劑的發(fā)現(xiàn)

        與抑制劑的發(fā)現(xiàn)相比,蛋白質(zhì)激活劑的發(fā)現(xiàn)更加困難,難點(diǎn)一在于很難通過計(jì)算預(yù)測(cè)別構(gòu)分子與靶蛋白結(jié)合后起上調(diào)或下調(diào)的作用;難點(diǎn)二在于激活劑往往使得蛋白質(zhì)處于能量較高、更加動(dòng)態(tài)的活性構(gòu)象,因此不能穩(wěn)定在單一構(gòu)象的狀態(tài),這使得激活劑與靶蛋白的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析更為困難。目前,發(fā)現(xiàn)激活劑的主要途徑依舊是高通量篩選,也有一些理性設(shè)計(jì)激活劑的例子被報(bào)道,如SIRT6激活劑的發(fā)現(xiàn)[33]等,尚無普遍適用的開發(fā)激活劑的方法。

        2.1.1 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶激活劑 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPx4),是一個(gè)含有硒的谷胱甘肽過氧化物酶。GPx4與細(xì)胞膜修復(fù)、炎癥及鐵死亡抑制等諸多生物調(diào)控過程相關(guān)[34]。上調(diào)GPx4的活性對(duì)于炎癥[13,35]以及鐵死亡相關(guān)的疾病治療[36]有益。因此,開發(fā)GPx4激活劑對(duì)于相關(guān)的疾病治療具有重要意義。

        Li等[37]使用CorrSite[22]和CAVITY[20]在GPx4的三維結(jié)構(gòu)上成功發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的別構(gòu)位點(diǎn)(見圖2A)。預(yù)測(cè)的別構(gòu)位點(diǎn)Cavity打分最高且CorrSite得分為1.5(CorrSite方法中通常將CorrSite得分大于 0.5的口袋預(yù)測(cè)為潛在的別構(gòu)位點(diǎn))。該別構(gòu)位點(diǎn)處于底物位點(diǎn)的背面,由3個(gè)酸性殘基(Asp21、Asp23和 Asp101)、2個(gè) 堿 性 殘 基(Lys31和Lys90)和7個(gè)非極性殘基(Ile22、Ala93、Ala94、Val98、Phe100、Met102和 Phe103) 包 圍。 通 過對(duì)SPECS化合物庫進(jìn)行計(jì)算虛擬篩選挑選后購買的251個(gè)化合物進(jìn)行酶活測(cè)試,最終得到激活劑分子PKUMDL-LC-001(1)?;衔?以劑量依賴性方式將人源GPx4 的U46C突變體(human GPx4 U46C mutant,hGPx4-C)的酶活性提高到原始酶活性的263%,其與hGPx4-C的平衡解離常數(shù)(KD)為(63±5)mol · L-1。對(duì)該化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后,得到活性提高的化合物1d4(2,見圖2B),其達(dá)到150%激活所需的濃度為20 mol · L-1。突變實(shí)驗(yàn)中,將別構(gòu)口袋中的關(guān)鍵氨基酸Asp21和Asp23突變后測(cè)試發(fā)現(xiàn),化合物1和2對(duì) 2個(gè)單突變(D21A和D23A)和1個(gè)雙突變(D21A/D23A)激活活性降低,證實(shí)化合物1和2結(jié)合在所預(yù)測(cè)的別構(gòu)位點(diǎn)上(見圖2C);敲除GPx4后,化合物1和2對(duì)于細(xì)胞提取物的激活效果消失,證明其在細(xì)胞中的特異性?;衔?對(duì)于鐵死亡的抑制、對(duì)于AA代謝網(wǎng)絡(luò)中炎癥前脂質(zhì)中間體的抑制以及對(duì)于核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路的抑制均進(jìn)一步證實(shí)其作用于GPx4。

        圖 2 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶別構(gòu)激活劑的理性設(shè)計(jì)[37]Figure 2 Rational design of glutathione peroxidase 4 activators[37]

        2.1.2 15-脂氧合酶激活劑 人網(wǎng)狀細(xì)胞15-脂氧合酶(15-lipoxygenase,15-LOX)是相對(duì)分子質(zhì)量為75 000的脂肪酸雙加氧酶,其產(chǎn)物15-羥基二十碳四烯酸(15-HETE)可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為具有抗炎活性和消炎能力的脂蛋白(lipoxins,LXs)[38]。上調(diào)15-LOX可以促進(jìn)抗炎因子生成且同時(shí)減少促炎因子[13],是潛在的治療炎癥相關(guān)疾病的靶點(diǎn)。另外,15-LOX與癌癥[39]和鐵死亡[40]密切相關(guān)。因此,針對(duì)15-LOX設(shè)計(jì)的激活劑,既能夠作為分子探針工具研究其功能也能夠開發(fā)為治療相關(guān)疾病的藥物。

        Meng等[41]應(yīng)用MutInf方法[27]尋找與15-LOX底物結(jié)合位點(diǎn)二面角運(yùn)動(dòng)相關(guān)性高的殘基,并結(jié)合CAVITY[20]判斷這些殘基是否適于形成可成藥口袋,成功地在15-LOX底物口袋附近找到一個(gè)新的別構(gòu)位點(diǎn)cavity 1。隨后,筆者實(shí)驗(yàn)室使用CorrSite[22]對(duì)15-LOX所有的潛在別構(gòu)口袋進(jìn)行了預(yù)測(cè),cavity 1的CorrSite得分為1.1,排名第三。與MutInf方法相比,CorrSite方法耗時(shí)少且使用方便。

        筆者實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)cavity 1使用SPECS化合物庫進(jìn)行計(jì)算虛擬篩選和實(shí)驗(yàn)研究,得到1個(gè)激活劑和11個(gè)抑制劑分子,其中激活劑分子PKUMDL_MH_1001(3)的半數(shù)激活常數(shù)(AC50)為(6.8± 0.4) mol · L-1,KD為(3.9±0.1)mol · L-1。虛擬篩選后對(duì)化合物進(jìn)行活性測(cè)試,獲得了另外2個(gè)激活劑分子。將激活劑與抑制劑化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn),激活劑分子中均包含可以與帶負(fù)電殘基形成強(qiáng)氫鍵的正電性基團(tuán)。隨后,筆者實(shí)驗(yàn)室對(duì)15-LOX的別構(gòu)激活及抑制機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)激活劑與Asp277形成氫鍵后可以穩(wěn)定15-LOX活性構(gòu)象,減少底物自抑制的作用;而抑制劑傾向于使活性位點(diǎn)口袋的“開合運(yùn)動(dòng)”受到阻礙[42]。突變實(shí)驗(yàn)表明化合物3對(duì)于15-LOX的突變體R242A和D277A的激活活性大幅下降,驗(yàn)證了化合物3結(jié)合在所預(yù)測(cè)的別構(gòu)位點(diǎn)(見圖3)。此外,在人的中性粒細(xì)胞、人全血和小鼠腹膜炎模型中,化合物3不僅增加了15-LOX的產(chǎn)物15-HETE水平,還減少了促炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。更有意義的是,化合物3與5-LOX或COX抑制劑的聯(lián)合使用可平衡AA代謝網(wǎng)絡(luò)中的不同途徑,這為阻斷炎癥的新策略提供了依據(jù)。

        圖 3 15-脂氧合酶激活劑的發(fā)現(xiàn)[41]Figure 3 Discovery of 15-lipoxygenase activator [41]

        2.2 別構(gòu)抑制劑的發(fā)現(xiàn)

        2.2.1D-3-磷酸甘油酸脫氫酶別構(gòu)抑制劑D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase,PHGDH)催化生物體內(nèi)合成絲氨酸的第一步反應(yīng),是絲氨酸合成的決速步驟。PHGDH在癌癥的發(fā)展中起著重要作用;PHGDH的基因敲除或使用PHGDH的小分子抑制劑都會(huì)大幅抑制對(duì)PHGDH敏感的細(xì)胞在體內(nèi)或體外的生長,對(duì)PHGDH不敏感的細(xì)胞系受到的影響則較小[43]。靶向PHGDH的抑制劑有著廣泛的應(yīng)用前景。由于PHGDH的底物口袋小,輔基NAD+在細(xì)胞中的濃度達(dá)到毫摩爾級(jí),正構(gòu)位點(diǎn)的抑制劑面臨選擇性差而無體內(nèi)活性的問題。因此,針對(duì)PHGDH設(shè)計(jì)別構(gòu)抑制劑是一種有效的策略。

        考慮到PHGDH的全長結(jié)構(gòu)尚未解出,Wang等[44]利用現(xiàn)有的僅包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)(Pdb code:2g76)使用CAVITY[20]程序進(jìn)行了別構(gòu)口袋的預(yù)測(cè),并獲得了2個(gè)別構(gòu)口袋(位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ,見圖4)。位點(diǎn)Ⅰ靠近活性位點(diǎn)和NAD+/NADH輔因子結(jié)合位點(diǎn),位點(diǎn)Ⅱ靠近底物結(jié)合域。隨后,筆者實(shí)驗(yàn)室對(duì)SPECS化合物庫進(jìn)行了計(jì)算虛擬篩選,得到1個(gè)結(jié)合在位點(diǎn)Ⅰ的化合物PKUMDLWQ-2101(4)和3個(gè)結(jié)合在位點(diǎn)Ⅱ的化合物:PKUMDL-WQ-2201(5)、PKUMDL-WQ-2202、PKUMDL-WQ-2203。其中活性最好的化合物4和5對(duì) PHGDH 的 IC50為(34.8±3.6) 和(35.7±8.6 )mol · L-1,二者與 PHGDH的KD分別為(0.56±0.10)和(66.9±1.9) mol · L-1。突變實(shí)驗(yàn)中,化合物4對(duì)于突變位置在別構(gòu)位點(diǎn)Ⅰ的PHGDH突變體R134A和K57AT59A,化合物5對(duì)于對(duì)于突變位置在別構(gòu)位點(diǎn)Ⅱ的PHGDH突變體T59A和T56AK57A的抑制活性均大幅降低,驗(yàn)證了化合物4和5分別結(jié)合在別構(gòu)位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,化合物4和5對(duì)PHGDH敏感性細(xì)胞系MDA-MB-468的EC50分別為 7.7 和 6.9 mol · L-1,同時(shí)對(duì) PHGDH 不敏感性細(xì)胞系呈現(xiàn)出很好的選擇性,表明在細(xì)胞中化合物4和5靶向作用于PHGDH。研究發(fā)現(xiàn),這2個(gè)化合物在PHGDH敲除后的細(xì)胞中均無特異性活性;二者還減少了絲氨酸合成通路及其下游通路的代謝產(chǎn)物的量,與PHGDH基因敲除的影響類似。此外,二者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也展現(xiàn)出了對(duì)于腫瘤組織的抑制效果。

        2.2.2 保羅樣激酶1的非ATP競爭型抑制劑 保羅樣激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與多步有絲分裂的賴氨酸/蘇氨酸激酶,其結(jié)構(gòu)包括識(shí)別底物的調(diào)控結(jié)構(gòu)域(Polo-box domain,PBD)和催化底物的激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain,KD)。研究表明人源PLK1在多種惡性腫瘤中過表達(dá)[45],抑制PLK1可以抑制癌細(xì)胞的生長[46-47],因此,PLK1被認(rèn)為是一個(gè)潛在的抗腫瘤靶標(biāo)。已有的PLK1抑制劑主要作用于KD的ATP結(jié)合口袋,是ATP競爭型抑制劑。該類抑制劑活性高但選擇性低,作為藥物使用產(chǎn)生的不良反應(yīng)較多,而非ATP競爭型抑制劑能夠提高選擇性以及延緩?fù)蛔僛48]。

        Yun 等[48]使用CAVITY[20]對(duì)PLK1晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了可成藥性口袋分析計(jì)算,在ATP結(jié)合位點(diǎn)的附近發(fā)現(xiàn)了全新的別構(gòu)口袋(見圖5A)。通過對(duì)別構(gòu)口袋中的位點(diǎn)Ⅱ進(jìn)行虛擬篩選并進(jìn)行PLK1體外酶活性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)了多個(gè)活性化合物。其中活性最好的化合物6對(duì)全長PLK1酶活的IC50為(13.1± 1.7)mol · L-1,與 ATP沒有競爭性結(jié)合(見圖5B)。

        圖 4 D-3-磷酸甘油酸脫氫酶別構(gòu)抑制劑研究[44]Figure 4 Study on D-3-phosphoglycerate dehydrogenase allosteric inhibitors[44]

        圖 5 保羅樣激酶1別構(gòu)抑制劑研究[48]Figure 5 Study on Polo-like kinase 1 allosteric inhibitors [48]

        3 結(jié)論和展望

        筆者實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了預(yù)測(cè)別構(gòu)位點(diǎn)的方法,預(yù)測(cè)了GPx4、15-LOX、PHGDH和PLK1中的別構(gòu)位點(diǎn),并分別針對(duì)這些位點(diǎn)成功發(fā)現(xiàn)了別構(gòu)調(diào)控分子。

        在過去的幾十年里,基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)大大加速了藥物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程。別構(gòu)藥物相對(duì)于正構(gòu)藥物所具有的高選擇性和抗耐藥性受到很多關(guān)注。越來越多的別構(gòu)藥物正被發(fā)現(xiàn),別構(gòu)藥物涉及的靶標(biāo)也從最初的G蛋白偶聯(lián)受體和激酶擴(kuò)展到現(xiàn)在的14種蛋白類別[10],也有不少別構(gòu)調(diào)控分子被發(fā)現(xiàn)。盡管有這些成功的例子,但是基于結(jié)構(gòu)的別構(gòu)藥物設(shè)計(jì)依然具有很大的挑戰(zhàn)性。主要在于以下3個(gè)方面:

        1)別構(gòu)位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。其一,目前有很多方法和軟件用于別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè),但因已知的適合用來訓(xùn)練和測(cè)試的別構(gòu)蛋白的樣本數(shù)量及計(jì)算量有限,這些預(yù)測(cè)方法本身的精度及適用性存在差異,還需要其他更多的研究來證明其有效性。其二,選擇什么樣的構(gòu)象開始進(jìn)行預(yù)測(cè)是研究人員在進(jìn)行別構(gòu)藥物設(shè)計(jì)時(shí)遇到的首要問題。最近,張健研究組發(fā)現(xiàn),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中正構(gòu)和變構(gòu)位點(diǎn)之間的距離小于5 ?時(shí),選擇結(jié)合底物的蛋白構(gòu)象作為基于結(jié)構(gòu)的變構(gòu)藥物篩選的初始輸入,有助于發(fā)現(xiàn)變構(gòu)藥物[49]。本文介紹的例子中,2個(gè)例子(PHGDH和PLK1)使用結(jié)合底物的蛋白構(gòu)象作為初始輸入,而預(yù)測(cè)得到的別構(gòu)位點(diǎn)都在活性位點(diǎn)附近,支持了此結(jié)論。其三,在別構(gòu)藥物設(shè)計(jì)中,有些別構(gòu)口袋在apo(不結(jié)合別構(gòu)藥物的構(gòu)象)狀態(tài)時(shí)不存在(hidden allosteric site),這種情況下可能需要進(jìn)行大規(guī)模分子動(dòng)力學(xué)模擬,結(jié)合馬爾科夫狀態(tài)模型(Markov state model)以獲得潛在的別構(gòu)位點(diǎn)[8]。

        2)別構(gòu)藥物的優(yōu)化(hit-to-lead optimization)。首先,別構(gòu)藥物的活性往往低于正構(gòu)藥物。由于別構(gòu)藥物的活性與其親和力并無直接關(guān)系,用傳統(tǒng)的方法對(duì)別構(gòu)藥物優(yōu)化時(shí),雖然可以提升藥物分子的親和力,但并不一定提升活性,因此產(chǎn)生“flat SAR”或者“l(fā)imited SAR”的現(xiàn)象。其次,別構(gòu)調(diào)控分子細(xì)微的差別即可能導(dǎo)致發(fā)揮的功能不同,理解別構(gòu)分子的機(jī)制對(duì)于別構(gòu)藥物優(yōu)化非常重要。 例如,筆者實(shí)驗(yàn)室的Bi等[50]在大腸埃希菌趨化研究中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)效應(yīng)分子(chemo effectors)類似物CHDCA和cis-PDA,二者分別是大腸埃希菌Tar受體的拮抗劑(antagonist)和引誘-劑(attractant),其結(jié)構(gòu)差別只是后者多了一個(gè)N H基團(tuán),通過與Tar受體的相互作用比較發(fā)現(xiàn),引誘劑都是在合適的位置(靠近Tyr149和Gln152)有1個(gè)氫鍵供體基團(tuán)作為信號(hào)的觸發(fā)基團(tuán)。因此,別構(gòu)調(diào)控分子發(fā)揮的作用可以分為兩部分:一部分用于與受體結(jié)合;另一部分起到信號(hào)觸發(fā)(trigger)的作用。類似的情況也在15-LOX激活劑的介紹部分提到過,即當(dāng)結(jié)合在別構(gòu)位點(diǎn)的分子沒有帶正電時(shí)成為抑制劑,而當(dāng)帶正電時(shí)就成為激活劑。綜上,別構(gòu)分子的優(yōu)化復(fù)雜且富有挑戰(zhàn)性。

        3)相對(duì)于正構(gòu)位點(diǎn),別構(gòu)位點(diǎn)的成藥性往往更差,別構(gòu)位點(diǎn)計(jì)算虛擬篩選的成功率也遠(yuǎn)低于正構(gòu)位點(diǎn),從而限制了別構(gòu)藥物的多樣性。

        別構(gòu)藥物的發(fā)展面臨著種種挑戰(zhàn),但是其在一些新的方向越來越受到關(guān)注。比如,開發(fā)別構(gòu)共價(jià)藥物,可以保留別構(gòu)藥物的優(yōu)勢(shì),同時(shí)也可以增加藥物-靶標(biāo)配體的半衰期從而降低毒性[51]。筆者實(shí)驗(yàn)室所開發(fā)的CovCys程序可以探測(cè)蛋白質(zhì)中能夠形成共價(jià)的半胱氨酸[25],該程序也已集成在CavityPlus中供直接使用[23]。另外,在開發(fā)別構(gòu)藥物對(duì)于蛋白-蛋白相互作用界面的調(diào)控[52],不可成藥靶標(biāo)的調(diào)控[53],通過別構(gòu)研究老藥新用[54-55]以及理解中草藥在治療復(fù)雜疾病時(shí)所發(fā)揮的作用[56]等方面也有進(jìn)展。從系統(tǒng)生物學(xué)及別構(gòu)網(wǎng)絡(luò)(allonetwork)的角度進(jìn)行別構(gòu)藥物的設(shè)計(jì)將會(huì)影響未來的藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。

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