【作 者】賀學(xué)英 ，湯菊莉 ，溫賢濤 ，管博，王蕊，王輝，李華，史建峰，曾亞力，毛永建

1 北京市醫(yī)療器械檢驗所，北京市，101111

2 醫(yī)療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室，北京市，101111

0 引言

以鎳合金為材料的醫(yī)療器械已得到廣泛應(yīng)用，總體安全性較好，但毒性案例也時有發(fā)生。盡管業(yè)內(nèi)對其毒性的研究也一直在進行，有關(guān)鎳元素的職業(yè)暴露的毒性已有較多研究，比如吸入、經(jīng)口攝入等[1-2]，但由于含鎳醫(yī)療器械如牙科種植體、血管支架等對患者的暴露方式獨特，歷史毒性限量的數(shù)據(jù)不能直接應(yīng)用。對該類產(chǎn)品的上市前生物相容性評價需根據(jù)GB/T 16886.1 《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第1部分 風(fēng)險管理過程中的評價和試驗》給出的原則和策略進行，包括全面的體外和體內(nèi)試驗，其中的亞慢性全身毒性研究是這些評價過程中非常重要的環(huán)節(jié)，但該類試驗需要大量樣品及較長時間的試驗周期，這對生物學(xué)評價的經(jīng)濟性和時效性都提出了很大挑戰(zhàn)[3]。

根據(jù)GB/T 16886.1給出的原則[3]：“材料表征”是生物相容性評價的最重要的前提，如已知含“鎳”產(chǎn)品，并根據(jù)文獻或業(yè)界共識認為產(chǎn)品的主要生物學(xué)風(fēng)險來自“鎳離子”的釋放或溶出，評價產(chǎn)品本身鎳溶出量與其未觀察到有害作用劑量（no observed adverse effect level,NOAEL）之間的關(guān)系將很大程度上減少對長期動物試驗的依賴，這符合生物相容性評價中的“3R原則”[4-5]，對該類產(chǎn)品進行科學(xué)、高效的生物相容性評價非常重要。本研究擬探討經(jīng)靜脈暴露途徑鎳的毒性限量值，以期指導(dǎo)含鎳醫(yī)療器械的生物相容性評價。

1 材料與方法

1.1 材料

氯化鎳NiCl2.6H2O （Sigma,Lot#SLBG1871V）；生理鹽水（雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；鎳鈦合金（Ni/Ti：55/45）（以下簡稱：GM，國內(nèi)某金屬材料有限公司）；SD大鼠（中國食品藥品檢定研究院，合格證號為SCXK（京）2009-0017）。

1.2 實驗方法

1.2.1 劑量組設(shè)定

根據(jù)實驗室鎳離子（Ni2+）體外細胞毒性試驗的結(jié)果[6]，設(shè)計第一階段實驗動物體內(nèi)毒性限量研究的給藥劑量；依據(jù)第一階段試驗數(shù)據(jù)，并參考Cramer決策樹（1978）II類中等毒性物質(zhì)TTC數(shù)據(jù)[7]，設(shè)計第二階段的劑量組，如表1所示。陰性對照為生理鹽水。每個組別20只SD大鼠（6～8周），雌雄各半。本研究IACUC編號為BIMT2013021。

表1 實驗分組Tab.1 Test groups

1.2.2 給藥途徑和周期

根據(jù)GB/T 16886.11—2011[5]，兩個階段試驗中，均采用14 d尾靜脈連續(xù)注射的方式，每次給藥體積為10 mL/kg。

1.2.3 臨床體征觀察

每日給藥前稱量大鼠體重，給藥后觀察并記錄實驗動物的一般臨床體征：行為、動作、反應(yīng)、呼吸、毛發(fā)、分泌、排泄、死亡等。死亡動物及時進行尸檢，觀察大體病理改變，如：充血、出血、腫脹、壞死等，并進行組織病理學(xué)檢測。

1.2.4 測定指標

最后一次給藥完成后，動物自由攝水，禁食過夜。次日應(yīng)用10%水合氯醛0.3 mL/100 g體重腹腔注射麻醉后腔靜脈采血，檢測血液及生化指標。

血液學(xué)指標：血紅蛋白濃度（HGB）、紅細胞計數(shù)（RBC）、紅細胞容積（HCT）、平均紅細胞容積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白（M C H）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)（RET）、白細胞計數(shù)（WBC）、白細胞分類計數(shù)、血小板計數(shù)（PLT）；臨床生化指標：總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TB）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酸激酶（CK）、肌酐（CR）、尿素（UREA）、血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、鉀（K）、鈉（Na）、氯（Cl）。

病理檢查：動物采血后，觀察并記錄各臟器的大體病變，取各主要臟器進行稱量記錄后，固定于福爾馬林中，備組織病理學(xué)檢查。

2 實驗結(jié)果

統(tǒng)計學(xué)工具采用SPSS V22。

2.1 第一階段研究試驗結(jié)果

2.1.1 臨床異常體征觀察

高劑量組所有動物在注射后即刻出現(xiàn)中毒體征：活動減少，呼吸加深，眼結(jié)膜充血，眼角出現(xiàn)分泌物；其中高劑量組雄性大鼠的死亡率達到60%，雌性大鼠死亡3只，其中1只的死亡與注射操作相關(guān)。中劑量和低劑量組未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，所有動物無死亡。

2.1.2 血液學(xué)結(jié)果

高劑量組雄性大鼠的血紅蛋白、紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、血小板計數(shù)等指標低于對照組，網(wǎng)織紅細胞計數(shù)高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異，而中性粒細胞則隨著劑量的增加而增加，并與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異；高劑量組雌性試驗大鼠除了淋巴細胞低于對照組、網(wǎng)織紅細胞和中性粒細胞計數(shù)高于對照組外，并未觀察到血紅蛋白、紅細胞計數(shù)和白細胞計數(shù)的降低，其中中性粒細胞的增加與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，有差異指標并未見量效關(guān)系。數(shù)據(jù)見表2和表3。

2.1.3 臨床生化分析

與對照組相比，隨著Ni2+濃度的增加，雌雄2個性別試驗組大鼠的ALT、AST、CR、UREA等濃度增加，提示肝、腎組織有毒性反應(yīng)；特別是雌性大鼠ALT在中、低劑量組，AST與ALP在中劑量組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，這幾個指標在同劑量組雄性大鼠未顯示毒性反應(yīng)，提示雌性動物的肝對Ni2+毒性反應(yīng)可能更敏感。同時看到甘油三酯濃度降低，盡管無統(tǒng)計學(xué)差異，但可見量效關(guān)系，可能與動物營養(yǎng)狀態(tài)相關(guān)。數(shù)據(jù)見表4和表5，其中未列出1.2.4中給出的臨床生化指標中其它無差異指標。

2.1.4 臟器系數(shù)結(jié)果

隨著Ni2+濃度的增加，試驗組雄性和雌性大鼠的心臟系數(shù)、肺臟系數(shù)增加，脾臟系數(shù)降低，其中肺臟系數(shù)的增加和脾臟系數(shù)的降低與對照組相比有明確的量效關(guān)系，見表6和表7。其它無差異指標未列出。

表2 暴露于Ni2+溶液大鼠血液學(xué)結(jié)果（性別：♂ ）Tab.2 Haematology results of rats exposed to Ni2+ (Male)

表3 暴露于Ni2+溶液大鼠血液學(xué)結(jié)果（性別：♀）Tab.3 Haematology results of rats exposed to Ni2+ (Female)

表4 暴露于Ni2+溶液大鼠生化指標結(jié)果（性別：♂）Tab.4 Clinical chemistry results of rats exposed to Ni2+ (Male)

表5 暴露于Ni2+溶液大鼠生化指標結(jié)果（性別：♀）Tab.5 Clinical chemistry results of rats exposed to Ni2+ (Female)

表6 暴露于Ni2+溶液大鼠臟器系數(shù)結(jié)果（性別：♂）Tab.6 Organs index of rats exposed to Ni2+ (Male)

表7 暴露于Ni2+溶液大鼠臟器系數(shù)結(jié)果（性別：♀）Tab.7 Organs index of rats exposed to Ni2+ (Female)

2.1.5 病理學(xué)觀察

對給藥期間死亡的大鼠進行尸檢觀察，肺臟等臟器蒼白，其余未見異常；組織病理學(xué)觀察高劑量組注射后死亡動物肝細胞急性壞死和出血，并伴發(fā)或不伴有其余臟器（心臟、肺、胸腺等）的淤血和出血。高劑量組大鼠的腎臟、肺和肝臟的淤血和充血重于對照組同性別大鼠，脾臟白髓和/或紅髓有不同程度的萎縮，并伴有邊緣區(qū)的增生。試驗組大鼠胸腺髓質(zhì)較對照組有輕度萎縮。其它組別大鼠各器官組織形態(tài)學(xué)無明顯異常。

2.2 第二階段研究試驗結(jié)果

在第一階段研究試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，劑量分別為1.2 mg/(kg·d)和0.25 mg/(kg·d)的2個限量組，與陰性對照組比較，主要結(jié)果如下：

血液學(xué)檢驗：限量組1中雄性大鼠網(wǎng)織紅細胞比對照升高，有顯著差異，其余指標變化無病理學(xué)意義。限量組2與對照組比較無差異。

生化分析：限量組1中雄性大鼠TG較對照組低，有統(tǒng)計學(xué)差異，其它指標變化無病理學(xué)意義。限量組2與對照組比較無差異。

病理學(xué)分析：限量組1中雌性大鼠肺臟器系數(shù)高于對照組，脾臟器系數(shù)低于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異；其它無異常。限量組2與對照組比較各臟器系數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異，組織病理學(xué)無形態(tài)學(xué)異常。

3 討論及結(jié)論

本研究中，采用多次靜脈給予SD大鼠定量的鎳離子溶液藥的方式進行鎳毒性限量研究，經(jīng)過2個階段亞慢性全身毒性研究，結(jié)果表明，在每日給藥劑量不大于0.25 mg/(kg·d)時，連續(xù)給藥14 d，大鼠未表現(xiàn)出亞慢性全身毒性反應(yīng)。因此我們可以根據(jù)待研究鎳鈦合金的鎳溶出特性來預(yù)測其依據(jù)GB/T 16886.11，以10 mL/(kg·d)連續(xù)14 d給藥進行的亞慢性全身毒性試驗的結(jié)果，即當待檢樣品浸提液中鎳離子濃度不大于0.025 mg/mL時，我們無需再進行亞慢性全身毒性動物試驗。

為驗證并調(diào)研常見鎳鈦合金材料鎳的亞慢性全身毒性與其溶出特性的關(guān)系，本實驗室選擇了國產(chǎn)及進口多個品牌的鎳鈦合金進行了相關(guān)研究。研究表明不同來源的鎳鈦材料，鎳溶出量相差可以到幾百倍[8]。我們選擇鎳溶出量最多的GM鎳鈦材料（以下簡稱GM）為研究對象，依據(jù)GB/T 16886.12的規(guī)定，以生理鹽水為浸提介質(zhì)，以0.2 g/mL浸提比例，經(jīng)37oC，72 h后，GM浸提液中鎳離子濃度約0.002 mg/mL[8-9]，以10 mL/kg體重給藥劑量計算，其給入大鼠體內(nèi)的量約為0.02 mg/(kg.d)，遠低于本課題所得每日0.25 mg/(kg·d)的NOAEL，預(yù)測該材料對實驗動物應(yīng)該無亞慢性全身毒性反應(yīng)。采用1.2節(jié)給出方法以GM浸提液進行大鼠亞慢性全身毒性試驗，結(jié)果顯示，實驗動物的血液學(xué)、生化檢查、病理觀察等各項指標均與對照組比較無顯著性差異。

毒理學(xué)關(guān)注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）原則是為所有化學(xué)物質(zhì)制定一個安全的人體暴露水平閾值[10]。基于實驗動物NOAEL數(shù)據(jù)進行推導(dǎo)時，常用的安全因子為100，由此推導(dǎo)出鎳對于人的TTC（經(jīng)靜脈）為2.5 μg/(kg·d)，以體重60 kg計算則其TTC為150 μg/d，根據(jù)Cramer決策樹（1978）對化合物的分類，屬于II類中等毒性物質(zhì)[7]?；诒緦嶒炇仪捌谘芯?，以GM鎳鈦合金為例，體外模擬浸提時其鎳離子的溶出速率為3.25 μg/(g·d)（3 d浸提的平均值。隨時間推移，單位時間溶出量會逐漸降低并基本達到平衡）[8]，如果在體內(nèi)鎳的溶出速率與體外相當，那么當使用該材料制成的醫(yī)療器械總質(zhì)量不超過46 g時，可預(yù)測該器械鎳離子帶給人體的風(fēng)險是可以接受的。當然材料的表征是應(yīng)用這些毒性限量數(shù)據(jù)的前提，不能科學(xué)測定材料中物質(zhì)的溶出特性就無從預(yù)測其在體內(nèi)的毒理學(xué)效應(yīng)；同時由于醫(yī)療器械構(gòu)成的復(fù)雜性，還應(yīng)考慮多種化合物同時暴露于人體的情況，因此在利用TTC數(shù)據(jù)時要慎重。