肖 捷 楊麗萍 肖 健 黃繼賢▲

1. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院體檢中心，廣東韶關(guān) 512025；2. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東韶關(guān) 512025；3. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東韶關(guān) 512025

自身免疫性溶血性貧血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）是一種人體B 淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)紊亂，產(chǎn)生針對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行破壞的自身抗體，繼而導(dǎo)致紅細(xì)胞壽命縮短和破壞加速為特征的獲得性免疫障礙貧血[1]。AIHA 的發(fā)病率約為3/10 萬，是一種少見病，近95% 成人和75% 的兒童患者為溫抗體型AIHA[2]。AIHA 好發(fā)于中老年，女性較男性常見。體液免疫在AIHA 發(fā)病機(jī)制中的作用已被認(rèn)識(shí)多年。近年來，細(xì)胞免疫在AIHA 發(fā)病機(jī)制中的重要作用逐漸引起重視。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞誘導(dǎo)和維持外周免疫耐受，對(duì)預(yù)防過度的免疫反應(yīng)和自身免疫中起至關(guān)重要的作用[3]。我們的前期研究[4]通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)AIHA 初治患者和正常人的外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（CD4+CD25+regulatory T cell，Tregs）后發(fā)現(xiàn)，初治患者的Tregs 較正常人下降，提示Tregs 與AIHA 的細(xì)胞免疫異常機(jī)制有關(guān)。因此，我們延長了研究時(shí)間，檢測(cè)了完全緩解和復(fù)發(fā)AIHA 患者外周血Tregs 的變化情況，以期進(jìn)一步確定Tregs 與AIHA 細(xì)胞免疫紊亂的可能關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009 年1 月～2019 年11 月就診于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院的AIHA 患者，均為溫抗體型AIHA。健康對(duì)照組來自同期我院體檢中心的正常人。

1.2 方法

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 納入的患者均至少完成血細(xì)胞分析、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、膽紅素、直接和間接抗人球蛋白試驗(yàn)、骨髓象、肝、膽、脾、胰B 超等檢查，AIHA的診斷標(biāo)準(zhǔn)以及療效判定標(biāo)準(zhǔn)均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)（第三版）》[5]。AIHA 復(fù)發(fā)的定義為AIHA 發(fā)病治療后達(dá)到完全緩解，其后疾病再次發(fā)作并達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)（第三版）》[5]的AIHA 診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有嚴(yán)重心、肝、腎臟等重要器官功能不全者；（2）預(yù)期生存期短于半年者；（3）不能或拒絕配合隨訪的患者。

1.2.3 Tregs 檢測(cè) AIHA 患者分別于初治時(shí)、治療后達(dá)完全緩解時(shí)、復(fù)發(fā)時(shí)采集外周血標(biāo)本，以 CD45、CD4 和 CD25 抗 體（均 是 BECKMAN COULTER 公司產(chǎn)品）熒光標(biāo)記活細(xì)胞及避光孵育，經(jīng)溶血素處理后再次避光孵育，磷酸鹽緩沖液洗滌后重新懸浮細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀（BD 公司的FACSCalibur 型）檢測(cè) CD4+T 細(xì)胞和 Tregs，具體方法參考我們的前期研究[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以（x± s）表示，各組間的比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱狀圖使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共收集到符合條件的AIHA 患者28 例，其中男 8 例，女 20 例，中位發(fā)病年齡 47 歲（14 ～ 77）歲?；颊咂鸩r(shí)的血紅蛋白中位數(shù)為54（23 ～102）g/L，總膽紅素中位數(shù)為42.20（7.40 ～165.64）μmol/L，間接膽紅素中位數(shù)為33.65（6.60 ～123.50）μmol/L，直接膽紅素中位數(shù)為10.65（0.80 ～53.23）μmol/L。健康對(duì)照組為同期的健康體檢者，均無自身免疫性疾病及腫瘤病史，且年齡和性別與AIHA 患者相匹配，男 8 例，女 20 例，中位發(fā)病年齡 47（14 ～ 77）歲。

2.2 CD4+T細(xì)胞的分析

初治組和復(fù)發(fā)組AIHA 的CD4+T 細(xì)胞比例均較健康對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表1，圖1A。而初治組AIHA 和復(fù)發(fā)組AIHA 的CD4+T 細(xì)胞比例雖均較完全緩解組低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

另外，初治組AIHA 的CD4+T 細(xì)胞比例和復(fù)發(fā)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；完全緩解組AIHA 的CD4+T 細(xì)胞比例和健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）

2.3 Tregs的分析

初治組和復(fù)發(fā)組AIHA 的Tregs 比例較健康對(duì)照組和完全緩解組均低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表 1，圖 1B。

另外，初治組AIHA 的Tregs 比例和復(fù)發(fā)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；完全緩解組AIHA 的Tregs 比例和健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

表1 各組外周血CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比較（x ± s，%）

圖1 （A）AIHA 初治組、復(fù)發(fā)組、完全緩解組和健康對(duì)照組外周血CD4+T 細(xì)胞的比較；（B）AIHA 初治組、復(fù)發(fā)組、完全緩解組和健康對(duì)照組外周血Tregs 的比較

3 討論

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是T 細(xì)胞的一個(gè)亞群，具有調(diào)節(jié)免疫、免疫抑制和維持自身耐受的功能，能夠通過產(chǎn)生白介素-10、轉(zhuǎn)化生長因子等細(xì)胞因子抑制機(jī)體T 細(xì)胞的活化、增殖和發(fā)揮效應(yīng)。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞按起源分為天然型調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（naturual regulatory T cell，nTreg）和誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（induced regulatory T cell，iTreg）。CD4+CD25+既是nTreg 免疫表型，也是iTreg 的免疫表型，且nTreg和iTreg 具有類似的免疫抑制功能[6]，但兩者的作用有所差別。nTreg 在胸腺中分化、發(fā)育和成熟，在增強(qiáng)對(duì)自身抗原的耐受性方面起關(guān)鍵作用；而在外周免疫器官中誘導(dǎo)發(fā)育成熟的iTreg，分布于外周淋巴組織，與nTreg 不同，偏向于識(shí)別非自身抗原[7]。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞被認(rèn)為通過各種可溶性細(xì)胞因子（包括IL-10，IL-35 和TGF-β）以及細(xì)胞表面分子（如CD25 和CTLA-4）（快速循環(huán)至/ 從細(xì)胞中回收）維持外周對(duì)自身抗原的耐受性方面至關(guān)重要[8]。

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的細(xì)胞比例異常與1 型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、多發(fā)性硬化、重癥肌無力等自身免疫病的發(fā)病機(jī)制可能有關(guān)。Ghonaim 等[9]對(duì)64 例1 型糖尿病患兒進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Tregs 后發(fā)現(xiàn)，1 型糖尿病患兒Tregs 減少，可能與1 型糖尿病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。Zhang 等[10]對(duì)37 例活動(dòng)期和18 例慢性期的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者及20 例正常人進(jìn)行Tregs 等指標(biāo)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的Tregs 比例顯著低于健康對(duì)照組，而活動(dòng)期組和慢性期組間則無明顯差異。Morita 等[11]對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與Treg相關(guān)的31 項(xiàng)研究進(jìn)行Meta 分析后發(fā)現(xiàn)，Tregs 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血的表達(dá)降低，而在滑液的表達(dá)卻升高。Li W 等[12]對(duì)總共納入628 例活動(dòng)期SLE 患者和601 例正常人的18 項(xiàng)研究進(jìn)行Meta 分析后發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期的SLE 患者的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞抑制能力未見異常，但活動(dòng)期調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞百分比較緩解時(shí)明顯下降，因而考慮，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的減少可能在活動(dòng)期SLE 的發(fā)病機(jī)理中起作用。Danikowski的研究表明[8]，雖然目前尚未完全闡明自我耐受能力受損在多發(fā)性硬化和重癥肌無力的潛在機(jī)制，但調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的數(shù)量、功能和（或）遷徙缺陷是可能的細(xì)胞免疫致病機(jī)制之一。

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞與AIHA 患者的細(xì)胞免疫紊亂可能有關(guān)。Mqadmi A 等[13]給對(duì)照組小鼠反復(fù)輸入少量異體紅細(xì)胞后AIHA 的發(fā)生率為30%；而發(fā)病組以CD25 單抗清除小鼠體內(nèi)的Tregs 后再反復(fù)輸入少量異體紅細(xì)胞，制成缺乏CD25 表達(dá)的AIHA模型，發(fā)現(xiàn)AIHA 的發(fā)生率上升至90%。此時(shí)如果輸注Tregs 給這些發(fā)病的小鼠，可減少紅細(xì)胞的自身抗體生成，繼而減輕溶血的發(fā)作；但不輸注Tregs而改為注輸注CD4+CD25-調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，卻不能減輕溶血發(fā)作。從而證明了Tregs 與小鼠的AIHA 的發(fā)病機(jī)制中的細(xì)胞免疫紊亂有關(guān)。我們的前期研究[4]通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血標(biāo)本分析AIHA患者和正常人的Tregs，發(fā)現(xiàn)AIHA 初治者的Tregs較正常人下降。孫麗霞等[14]也通過流式細(xì)胞儀對(duì)AIHA 初治者、緩解的AIHA 患者和正常人的外周血標(biāo)本進(jìn)行Tregs 檢測(cè)，得出了與我們前期研究相同的結(jié)論（初治AIHA 患者的Tregs 較正常人下降），并發(fā)現(xiàn)緩解AIHA 患者Tregs 較發(fā)病時(shí)顯著上升。本研究再次驗(yàn)證了我們前期研究及孫麗霞等[14]的結(jié)論，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的AIHA 患者的外周血Tregs 也較正常人下降，與初治患者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從而進(jìn)一步證明了外周血Tregs 與AIHA 的細(xì)胞免疫紊亂機(jī)制可能有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，AIHA 初治組和復(fù)發(fā)組CD4+T細(xì)胞比例均較健康對(duì)照組低。國內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)特發(fā)性血小板減少性紫癜的患者，發(fā)病時(shí)檢測(cè)外周血CD4+T 細(xì)胞比例也減少[15]。本研究結(jié)果提示CD4+T細(xì)胞可能也與AIHA 的發(fā)病有關(guān)，其細(xì)胞比例的異常是否與Tregs 導(dǎo)致CD4+T 細(xì)胞的活化和增殖受限有關(guān)，值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，Tregs 在維持外周對(duì)自身抗原的耐受性方面至關(guān)重要，與自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，AIHA 初發(fā)病和復(fù)發(fā)患者的外周血Tregs 均較完全緩解和正常人下降，治療達(dá)完全緩解時(shí)明顯上升，與正常人無明顯差異，進(jìn)一步提示Tregs 與AIHA 患者發(fā)病的細(xì)胞免疫紊亂機(jī)制可能有關(guān)。