宋彩紅，齊 輝，魏自民，席北斗

（1.聊城大學生命科學學院，山東 聊城 252000；2.東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；3.中國環(huán)境科學研究院環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012）

近年來，關于堆肥過程接種外源微生物菌劑問題受到關注。堆肥土著微生物種類和數量可滿足堆肥需要，因此無需額外接種[1-2]。接種微生物菌劑在提高堆肥效率方面效果不穩(wěn)定，并可能在與堆肥土著微生物競爭過程中死亡[3]。Nakasaki 等認為特殊物料堆肥單純依靠土著微生物，存在堆肥效率低下、質量差問題，需接種功能微生物菌劑[4]。餐廚垃圾富含油脂等易降解有機質，堆肥初期易出現小分子有機酸累積現象，導致堆料酸化、微生物活性受抑制，堆溫延滯上升，甚至發(fā)酵崩潰[5-6]，研究表明接種高效有機酸降解菌劑可有效解決此問題[7-8]。

有機酸降解菌劑主要分為單一菌種[4-5,8]和混合培養(yǎng)復合菌系[9]，單一菌種菌劑對堆肥環(huán)境適應能力較差、效果不穩(wěn)定，通過接種畢赤酵母，可有效解決餐廚垃圾堆肥初期酸化抑制問題，但該菌劑在高溫期無法存活[4]。課題組前期研究表明，抗酸化微生物復合菌系AAMC 接種，不但可有效提高餐廚垃圾堆肥效率，還顯著提高腐殖酸數量和結構穩(wěn)定性，改善堆肥品質[10]。堆肥是多種微生物發(fā)揮功能復雜體系[11]，接種微生物與土著微生物存在競爭關系，土著微生物間存在競爭與協(xié)作關系[1]。目前，AAMC 菌劑與堆肥土著微生物關系不清，菌劑接種效果不穩(wěn)定，限制后期實際應用。本研究通過對比AAMC 接種堆肥、添加化學緩沖劑堆肥和自然堆肥，從細菌、真菌和放線菌三大類群全方位揭示堆肥土著微生物演替響應AAMC菌劑規(guī)律，揭示堆肥土著微生物與AAMC 關系，以期為AAMC工廠化應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

餐廚垃圾取自中國環(huán)境科學研究院職工食堂，堆肥前對餐廚垃圾預處理，具體方法參見前期研究[10]；麩皮取自順義實驗基地附近農戶，本研究作為調理劑使用，調節(jié)堆料含水率和C/N，堆料具體性質見表1。

表1 堆肥材料理化性質Table 1 Physicochemical characteristics of composting substrates

1.2 AAMC篩選和馴化

AAMC篩選、馴化和構建方法已在前期研究中展示[10]，此處不再贅述。該復合菌系由2種Pseudo?monas、2 種Bacillus、1 種Dysgonomonas、1 種Lac?tobacillus和1種Aeribacillus菌種組成。

1.3 試驗設計

將餐廚垃圾與麩皮按比例充分混合均勻，得到堆肥混合物理化性質如下：C/N為25.6；含水率為60.6%。設置3 個堆肥組，結果見表2。①接種組：堆肥前于堆肥混合物接入處于對數期抗酸化復合菌系AAMC（菌體濃度為1×108CFU·mL-1），接種量為1.25 mL 菌液·kg-1堆料（以干基計）；②加堿組：添加堿性化合物MgO 和K2HPO4，以緩解堆肥初期密集酸化導致pH 下降，添加量分別為0.05 mol·L-1MgO·kg-1堆料和0.1 mol·L-1K2HPO4·kg-1堆料（以干基計）；③設立自然堆肥組為空白對照。采用在線監(jiān)測反應器堆肥[12]，試驗過程中使通風量保持在0.5 L·min-1·kg-1，實時監(jiān)測堆溫和含水率，定期翻堆。在堆肥30 h、2 d和30 d取樣，分別作為升溫期、高溫期、降溫和腐熟期樣品，置于-20 ℃保存，用于PCR-DGGE分析。

表2 堆肥試驗設計Table 2 Composting experimental design

1.4 理化指標分析

溫度：堆肥裝置在線監(jiān)測記錄；C/N、pH和有機質分別采用元素分析儀、pH計和馬弗爐測定，方法參照文獻[7,10]；含水率：采用差重法測定[10]。

1.5 微生物群落分析

采用PCR-DGGE 技術檢測堆肥細菌、真菌和放線菌群落多樣性，DNA 提取和純化采用MOBIO Power Soil 基因組提取試劑盒（美國Mobio）。細菌PCR體系和擴增程序、DGGE條件、優(yōu)勢條帶切膠回收參見文獻[13]，真菌擴增引物為Fung-GC（GC-clamp-5' ATTCCCCGTTACCCGTTG-3' GC-clamp：5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCC CCGCCCC 3'）和 NS1（5' GTAGTCATATGCTTGTCTC 3'）PCR 體系：10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、MgCl24 μL、引物（10 μM）各1 μL、ExTaq（大連TaKaRa）1.5 U、模板DNA 20～50 ng、滅菌超純水補齊至50 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60～50 ℃30 s，72 ℃ 1 min，10 個循環(huán)；94 ℃ 30 s， 58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，20個循環(huán)；72 ℃ 10 min。DGGE條件：膠濃度為6%～12%（M·V-1），上樣量為15 μL，60 ℃下 65 V 電泳 16 h，SYBREGreen 染色。優(yōu)勢條帶切膠回收參見文獻，其中第二輪pcr擴增引物和程序同上。放線菌PCR 體系和擴增程序、DGGE 條件、優(yōu)勢條帶切膠回收參見文獻[14]，細菌、真菌和放線菌測序工作均由北京市理化分析測試中心完成。

1.6 數據分析

通過Quantity one v4.62軟件將DGGE凝膠圖譜數字化后，按照Vivas 等[15]方法對DGGE 圖譜中各泳道微生物作香農指數（H'）和辛普森指數（D）分析，H'通過公式H'=-ΣPilnPi計算，D通過公式D=ΣPi2計算，其中，Pi是泳道中條帶相對信號強度。

2 結果與分析

2.1 細菌演替規(guī)律分析

2.1.1 細菌DGGE圖譜分析

圖1 顯示3 個處理堆肥過程DGGE 條帶種類和分布差異較大，接種組DGGE條帶數顯著高于對照和加堿組，說明接種AAMC 增加細菌多樣性。條帶1、5、21、22、32、33、34、35、36、37 和39為接種組特有條帶，而這些條帶并非來源于所接種AAMC，說明接種AAMC可能激發(fā)新細菌種類產生，尤其是在升溫期。條帶A、B、C、D、E、F、G為AAMC中主要細菌種類。

由圖1可知，條帶A～G在接種組中均為優(yōu)勢條帶，說明來源于餐廚垃圾堆肥AAMC 適應餐廚垃圾堆肥環(huán)境良好，發(fā)揮其有機酸降解功能。與對照組相比，加堿組高溫期DGGE 條帶數顯著降低，這可能與其較高堆溫有關，Nakasaki 等研究表明，高溫對細菌有篩選作用[4]。

2.1.2 細菌群落多樣性分析

H'反映物種豐度和分布均勻性，與物種多樣性呈正相關[16]。D反映物種多樣性，呈負相關[17]。由圖2 可見，接種和加堿組H'在堆肥過程中均呈現先降后升變化趨勢，由堆肥溫度變化對細菌群落結構躍遷影響所致；D均呈現先升后降變化趨勢，反映高溫對細菌群落篩選作用，這與H'研究結論一致。對照組H'和D變化較小，這與其堆肥過程較平穩(wěn)溫度變化有關[3]。在堆肥周期中，接種組H'均高于加堿組和對照組，D低于其他兩組，尤其在升溫期，說明接種AAMC 可提高餐廚垃圾堆肥細菌多樣性，與接種菌劑可引入微生物有關，也與所引入AAMC 在餐廚垃圾堆肥中良好定殖狀況和激發(fā)新細菌種類產生有關（見圖1）。在高溫期，加堿組H'明顯低于對照組，D高于對照組，添加化學緩沖劑降低細菌群落多樣性，而在堆肥腐熟期，隨溫度降低和細菌對堿性環(huán)境適應，多樣性恢復。

2.1.3 細菌優(yōu)勢群落分析

優(yōu)勢條帶測序結果見表3。39個條帶被成功測序。接種組特有條帶1、5、21、22、32、33、34、35、36、37和39，分別屬于Legionella、Aerib?acillus、Deinococcus、 Uncultured bacterium、Aneu?rinibacillus、Sphingobacterium、Escherichia、Sphin?gobacterium、Flavobacterium、Bacillus和Pusillimo?nas。課題組前期揭示上述Legionella、Deinococ?cus、Escherichia和Bacillus是乙酸和丙酸代謝途徑關鍵酶來源菌[3]，說明接種AAMC 激發(fā)乙酸和丙酸降解關鍵細菌產生，接種組升溫期（此階段正對應對照組酸化抑制期）檢測條帶34（Escherichia）和37（Bacillus），這可能是接種組避免初期酸化抑制原因之一。Karadag 等報道Sphingobacterium和Flavo?bacterium與木質素降解有關[18]，而木質素降解過程與腐殖酸合成緊密相關[19]。接種組特有條帶33、35和36 屬于此兩屬，且這3 個條帶分別來自接種組升溫期、腐熟期和高溫期，說明接種AAMC在堆肥周期內可激發(fā)木質素降解細菌產生，這與接種組堆肥較高腐殖化程度相關[10]。

課題組前期通過宏蛋白質組學揭示乙酸和丙酸降解關鍵細菌還有：Bacillus（條帶14、16、17、18、19、28、29、31 和 37）、Pseudomonas（條帶4、6、9 和 26）、Staphylococcus（條帶 20）和Strepto?coccus（條帶7和13）[3]。由于餐廚垃圾堆肥酸化抑制主要發(fā)生在初期階段，對比不同處理升溫期乙酸和丙酸降解關鍵細菌。對照組檢測到4、6、9、13四個條帶，屬于Pseudomonas和Streptococcus兩個屬；加堿組有7、13、19、28 四個條帶，屬于Streptococcus和Bacillus兩個屬；接種組有 13、17、28、29、31 五個條帶，再加上接種組分布在升溫期特有條帶34 和37，共檢測到7 個乙酸和丙酸降解關鍵細菌種類，分別屬于Streptococcus、Bacillus和Escherichia3 個屬。上述結果顯示堆肥升溫期接種組乙酸和丙酸降解關鍵細菌多樣性明顯高于加堿組和對照組，這可能是接種AAMC 能克服初期酸化抑制主要原因。與對照組相比，加堿組在升溫期乙酸和丙酸降解關鍵細菌多樣性并無明顯差異，僅是細菌種類不同。

此外，檢測到乳酸產生菌Lactobacillus[20]（條帶8、10和11）和Weissella[5]（條帶3），3個處理在升溫期都檢測到乳酸產生菌（接種組：3種；加堿組：2種；對照組：2 種），在腐熟期對照組仍檢測到所有4種乳酸產生菌，加堿組檢測到1種，接種組未檢測到。研究表明Aeribacillus（條帶5）分泌羧甲基纖維素酶，此酶主要參與多糖和木質纖維素降解[21]、Mei 等發(fā)現Serratia（條帶 25）和Aneurinibacil?lus（條帶 32）具有降解木質素能力[22]。Thermobacil?lus（條帶38）是嗜熱細菌，具有木聚糖降解功能。上述木質纖維素降解菌在接種組檢測到3種，在對照組檢測到2種，在加堿組僅檢測到1種，且在腐熟期僅有接種組檢測到兩種木質素降解菌（條帶25和32），其他兩組均未檢測到，這可能與接種組較高腐殖酸程度有關[10]。Sporosarcina（條帶15）是耐酸菌，在低pH 條件下可阻止H+進入其細胞質[23]，僅在對照組檢測到，對照組堆料長期處于酸化狀態(tài)。Francis 等報道Pantoea agglomerans（條帶24）是兼性厭氧菌，以乙酸為電子供體、Fe（Ⅲ）為電子受體作電子傳遞，同步降解復雜有機物[24]。

本研究在接種組堆肥周期內均檢測到Pantoea agglomerans分布，說明Pantoea agglomerans對接種組堆肥過程中乙酸代謝發(fā)揮重要作用，對接種組克服酸化抑制起積極作用。在加堿組升溫期檢測到Pantoea agglomerans，說明Pantoea agglomer?ans在加堿組緩解堆肥初期酸化抑制過程中發(fā)揮重要作用。

表3 細菌DGGE條帶測序比對結果Table 3 Sequence analysis of bacterial DGGE bands

2.2 真菌演替規(guī)律分析

2.2.1 真菌DGGE圖譜分析

圖3 展示3 個堆肥處理真菌DGGE 條帶分布，本研究檢測到土著真菌（對照組檢測到條帶）有條帶 1、2、4、5、7、9、10、11、12、13、14、15和17。與對照組相比，接種組土著真菌條帶10、14和15消失，而新檢測到條帶6、8和16，說明接種AAMC（細菌）也對堆肥真菌群落演替產生影響，這種影響包括促使某些土著真菌消亡和激發(fā)新真菌種類產生。與接種組類似，加堿組土著真菌條帶14、15和17消失，而新檢測到條帶3、8、16和18，說明添加化學緩沖劑也對真菌躍遷產生影響。與其他兩處理相比，在升溫期接種組真菌種類明顯降低，而其細菌多樣性明顯升高（見圖1 和3），原因是細菌多樣性提高對真菌群落生長和繁殖產生抑制作用。

2.2.2 真菌群落多樣性分析

由圖4可知，在堆肥過程中，對照組H'變化不明顯；加堿組H'顯著下降；接種組H'先升后降。一般來說，由于高溫對微生物篩選作用，在高溫期堆肥微生物多樣性降低，進入腐熟期后隨堆溫降低，多樣性回升[5]。對照組H'平穩(wěn)變化趨勢與其堆肥過程中較低堆溫對真菌篩選作用微弱有關。接種組H'變化趨勢與上述規(guī)律不一致，原因是AAMC 接種激發(fā)3 個DGGE 條帶均分布在高溫期，對高溫有較強抵抗力（見2.2.3）。D在3個處理中變化趨勢與H'完全相反，說明D結果佐證H'分析結果良好。

2.2.3 真菌優(yōu)勢群落分析

圖3中18種DGGE條帶被成功測序，結果見表4。本研究前期結果顯示Saccharomyces（條帶1和8）和Candida（條帶3 和7）是乙酸和丙酸降解關鍵真菌[3]。升溫期，對照組并未檢測到此4 種條帶，而接種組檢測到條帶7和8，加堿組檢測到條帶1、3、7 和8，原因可能是接種AAMC 和添加化學緩沖劑能克服和有效避免初期酸化抑制。接種組新激發(fā)產生條帶6、8 和16，分別屬于Melanocarpus、Sac?charomyces和Aspergillus，前期研究顯示Melanocar?pus能分泌漆酶，主要作用于木質素降解，Saccha?romyces與乙酸和丙酸代謝緊密相關（前述內容已有分析），Aspergillus主要作為用于纖維素降解[3]。條帶6在接種組高溫和腐熟期為優(yōu)勢菌，在其他兩處理均未檢測到，由于在堆肥過程中木質素降解與腐殖質合成緊密相關，推測接種組高溫期和腐熟期Melanocarpus存在與其較高腐殖質含量和腐殖化程度有關。條帶16 在接種組和加堿組高溫期為優(yōu)勢菌，說明這兩個處理在高溫期纖維素降解即活躍，揭示接種和加堿組加速堆肥進程。

表4 真菌DGGE條帶測序比對結果Table 4 Sequence analysis of fungal DGGE bands

此外，還檢測到Eremothecium cymbalariae（條帶2）、Galactomyces geotrichum（條帶5）、Neurospo?ra（條帶 4、12 和 18）、Schizosaccharomyces pombe（條帶10）、Thermomyces lanuginosus（條帶11）、De?baryomyces（條帶 9）、Paracoccidioides（條帶 14）、Yarrowia lipolytica（條帶13）和未培養(yǎng)真菌（條帶15和17）。Leeuw 等報道Eremothecium是重要植物病原菌[25]，本研究在加堿和對照組高溫期及接種組腐熟期均檢測到此種真菌。Galactomyces geotrichum可降解甲基紅等染料，常用于紡織和造紙等行業(yè)染料劑處理[26]。Galactomyces geotrichum在 3 個堆肥處理均為優(yōu)勢菌，可視為餐廚垃圾堆肥土著真菌。Lin 等報道Neurospora可分泌胞外脂肪酶，在餐廚垃圾富含油脂降解過程中發(fā)揮重要作用[27]。本研究除條帶18僅在加堿組高溫期檢測到外，條帶4和12 在3 個處理堆肥過程中均分布。Thermomyces lanuginosus為耐熱真菌，在木聚糖（半纖維素成分）降解過程中發(fā)揮重要作用[28]。本研究在3 個堆肥處理升溫期和接種組高溫期均檢測到Thermomy?ces lanuginosus。Debaryomycessp.具 有 較 強 耐 鹽性，在木糖發(fā)酵產木糖醇過程中有大量應用[29]。這種耐鹽真菌在3 個堆肥處理堆肥周期均為優(yōu)勢菌，與餐廚垃圾物料含鹽量較高有關。Yarrowia lipolyti?ca可分泌胞外脂肪酶，主要作用于油脂類降解[30]。條帶13 在加堿和對照組升溫期及接種組腐熟期均為優(yōu)勢菌。

2.3 放線菌演替規(guī)律分析

2.3.1 放線菌DGGE圖譜分析

圖5 展示3 個堆肥處理放線菌DGGE 條帶分布，本研究檢測到土著放線菌（對照組檢測到條帶）有條帶1、2、3、7、8、9、12、14、15、21、22、23、25、27、28、31、34 和35。與對照組相比，除條帶9、23、31 和34 外，其他土著真菌條帶在接種組中全部消失，而新檢測到11 個放線菌條帶（條帶 5、10、13、19、20、24、26、29、30、32和33），這些現象說明接種AAMC（細菌）對放線菌群落躍遷產生顯著影響，這種影響包括促使某些土著放線菌消亡和激發(fā)新放線菌種類產生。與加堿組類似，除條帶9、21、23、31 和34外，其他土著真菌條帶在加堿組中全部消失，而新檢測到條帶 4、6、11、16、17、18、24、26、32 和33，說明添加化學緩沖劑也對放線菌群落演替產生顯著影響。在升溫期加堿組放線菌種類明顯低于接種和對照組，而在高溫期放線菌種類相比升溫期大幅增多，此時放線菌種類多于接種和對照組，說明雖放線菌類最適生長pH呈堿性，但在投加化學緩沖劑后較短時間內，餐廚垃圾堆肥體系pH突然升高并未促進放線菌類生長，對其生長有抑制作用，這種抑制作用隨堆肥進程轉成促進作用。

2.3.2 放線菌群落多樣性分析

由圖6可知，接種組H'變化平穩(wěn)，而加堿和對照組H'均呈先升后降變化趨勢，與Tran等[5]研究結論不一致，原因是接種和加堿組由于人為調控添加微生物菌系和化學緩沖劑打破堆肥過程放線菌演替一般規(guī)律，可一定程度削弱溫度對放線菌群落結構躍遷影響，而這種削弱作用在加堿組更明顯，與放線菌最適生長pH 呈堿性有關。對照組溫度較低，無明顯高溫對放線菌群落組成篩選作用。在升溫期，加堿組H'（1.38）明顯低于接種（2.07）和對照組（2.15），而在高溫期H'有一個顯著升高（2.63），這與前述結果一致。D在3 個處理中變化趨勢與H'完全相反，說明D結果佐證H'分析結果良好。

2.3.3 放線菌優(yōu)勢群落分析

優(yōu)勢條帶測序結果見表5。

表5 放線菌DGGE條帶測序比對結果Table 5 Sequence analysis of actinobacterial DGGE bands

35 個條帶被成功測序。本研究前期結果顯示，Corynebacterium（條帶29）、Mycobacterium（條帶5和20）和Rhodococcus（條帶10、32和34）是乙酸和丙酸降解關鍵放線菌[3]。升溫期，不同處理檢測到上述條帶數分別為接種組4個、加堿組2個、對照組1個，說明接種AAMC（細菌）提高乙酸和丙酸降解放線菌種類，有效避免堆肥初期酸化抑制問題。本研究檢測到多種Acidothermus（條帶16、17、26 和28）和Streptomyces（條帶7、9、21、27 和31）放線菌種類，Mohagheghi等報道Acidothermus是嗜熱、嗜酸放線菌，具有降解纖維素能力[31]。加堿組高溫期檢測到條帶16、17 和26，接種組升溫期檢測到條帶26，對照組高溫期檢測到條帶28。Streptomyces有效降解木質纖維素[32]，在對照組檢測到5 個Streptomyces種類，加堿組和接種組分別檢測到3 個和2 個Streptomyces種類。由上述結果可知，接種AAMC 或添加化學緩沖劑并未顯著提高纖維素或木質纖維素降解放線菌種類。

此外，在本研究餐廚垃圾堆肥過程中檢測到Frankia（條帶 1、4 和 8）、Nocardioides（條帶 2 和30）、Saccharomonospora（條帶24 和33）、Salinispo?ra（條 帶 12 和 35）、Thermomonospora（條 帶 6 和11）、Arthrobacter humicola（條帶 14）、Geoderma?tophilus arenarius（條帶 3）、Kocuria（條帶 19）、Leif?sonia bigeumensis（條帶 18）、Micrococcus（條帶 13）、Tropheryma whippelii（條帶15）和3 種未培養(yǎng)放線菌種類（條帶22、23 和25）。Yin 等報道Frankia放線菌具有固氮作用，對照組檢測到兩種Frankia放線菌，加堿組檢測到1 種，而接種組未檢測到[33]。Webb 等報道Saccharomonospora有降解農藥五氯苯酚能力，所有堆肥處理均檢測到2 種Saccharo?monospora放線菌[34]。Salinispora產生抗生素，僅在對照組檢測到2種Salinispora放線菌[35]。Sakon 等報道Thermomonospora分泌內切和外切纖維素酶[36]，本研究僅在加堿組高溫期檢測到2種Thermomonos?pora放線菌種類。

3 結 論

a.AAMC中7種主要細菌在接種組中均為優(yōu)勢條帶，說明AAMC 在接種組定殖狀況良好，適應餐廚垃圾堆肥環(huán)境良好。

b.乙酸和丙酸降解關鍵微生物：接種組共檢測到7 個細菌種類，2 個真菌種類和4 個放線菌種類，顯著高于加堿（細菌：4個，真菌：4個，放線菌：2個）和對照組（細菌：4個，真菌：0個，放線菌：1 個），說明接種AAMC 可激發(fā)乙酸和丙酸降解關鍵微生物產生。

c.接種AAMC激發(fā)木質素降解細菌和真菌種類產生，但并未顯著提高木質纖維素降解放線菌種類；接種AAMC 顯著增加堆肥過程細菌多樣性，對真菌和放線菌多樣性影響不明顯，但均顯著改變3個類群群落結構躍遷規(guī)律，包括激發(fā)新微生物種類產生并促進某些土著微生物消亡。添加化學緩沖劑顯著改變土著微生物演替規(guī)律。