王海強 王瑤 李國慶 劉朝霞 王琳晶 田延昭 欒鳳 艾宗雄

摘要?目的：研究不同劑量的腸愈寧顆粒對潰瘍性結腸炎（UC）模型大鼠結腸血清白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-4（IL-4）表達的影響，闡述其抗UC的免疫機制。方法：48只雄性Wistar大鼠平均隨機分成6組：空白對照組、模型組、腸愈寧高劑量組、腸愈寧中劑量組、腸愈寧低劑量組、美沙拉嗪對照組。應用三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇復合灌腸法誘導UC大鼠模型，評估疾病活動指數(shù)（DAI），結腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）并進行組織損傷指數(shù)（TDI）評分，酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測大鼠IL-1β、TNF-α、IL-4的變化。結果：注入5% TNBS 50 mg/kg+50%乙醇0.25 mL連續(xù)1周可成功導致大鼠患上潰瘍性結腸炎（UC），腸愈寧顆?？蓪?% TNBS 50 mg/kg+50%乙醇所致的大鼠UC，與模型組比較，加入腸愈寧高劑量組、腸愈寧中劑量組的DAI、CMDI和TDI評分均降低，IL-1β、TNF-α表達下調(diào)，IL-4表達上調(diào)。結論：腸愈寧顆粒抵抗?jié)冃越Y腸炎（UC）的作用顯著，其機制可能與下調(diào)促炎因子TNF-α以及白細胞介素IL-1β的表達，上調(diào)促炎因子IL-4的表達有關。

關鍵詞?腸愈寧顆粒;潰瘍性結腸炎;血清白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-4

Abstract?Objective：To investigate the different doses of Changyuning granules on the expression of IL-1β，TNF-α and IL-4 in mice with ulcerative colitis （UC） and observe its immune mechanism against UC. Methods：Forty-eight male wistar rats were randomly divided into six groups：control group，model group， high-dose group，medium-dose group，low-dose group of Changyuning granules， mesalazine group.The UC models were established by TNBS/ethanol composite enema， disease activity index （DAI），colon macroscopic damage index （CMDI） and tissue damage index （TDI） were assessed.Serum IL-1β，TNF-α and IL-4 were detected by ELISA. Results：Injection of 5% TNBS 50 mg/kg+50% ethanol 0.25 mL for one week could successfully lead to ulcerative colitis （UC） in rats and Changyuning granules can resist UC induced rats.Compared with the model group，the DAI，CMDI and TDI scores of the high-dose group and the middle-dose group of Changyuning granules were all reduced，the expression of IL-1β， TNF-α was down-regulated and the expression of IL-4 was up-regulated. Conclusion：Changyuning granules have significant resistance to ulcerative colitis （UC）.The mechanism may be related to reducing the expression of the TNF-α as well as IL-1β and increasing the expression of the IL-4.

Keywords?Changyuning; Ulcerative colitis; IL-1β; TNF-α; IL-4

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.17.010

潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種以腸道惡變和黏膜損傷為特征的胃腸道慢性病[1]。作為炎性反應性腸?。↖BD）的一種主要形式[2]，往往伴有緩解期和復發(fā)期且其黏膜炎性反應僅局限于結腸[3]。臨床表現(xiàn)包括腹部痙攣、疼痛、血痢[4]、直腸出血[5]、體質(zhì)量減輕、發(fā)熱和易疲勞性。目前潰瘍性結腸炎（UC）腸道炎性反應性疾病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率正在增加[6]。而對于UC這方面的研究雖然已經(jīng)取得了相當大的進展，但是對于UC患病具體病因尚不明確[7]，臨床上，治療UC的藥物較多，雖然療效較好，但是不良反應多，患者長期依從性較難，因此從中醫(yī)藥尋找新的治療藥物仍然是本病的研究熱點。

本課題組具有多年使用中藥復方治療結腸炎的臨床實踐，并結合藥效學實驗發(fā)現(xiàn)腸愈寧方治療大腸濕熱型潰瘍性結腸炎效果顯著。據(jù)文獻記載，疾病活動度與菌免疫系統(tǒng)相關遞質(zhì)相關，隨著病情加重，患者的免疫力也逐漸下降[8-9]。Fuchs等也假設UC可能主要是由一種免疫失衡的狀態(tài)而引起的[10]。因此本項目組在前期用腸愈寧方來治療患有潰瘍性結腸炎的效果較好基礎上，旨在研究腸愈寧方治療活動期潰瘍行結腸炎的作用機制，深入研究中藥治療潰瘍性結腸炎的作用機制，可為抗?jié)冃越Y腸炎新藥的研發(fā)提供新思路。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?雄性Wistar大鼠48只，實驗動物使用許可證編號：SYXK（黑）-2016-0005，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。在濕度、溫度適宜且通風的動物室內(nèi)飼養(yǎng)。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物管理和使用委員會審核，符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》和《實驗動物使管理和使用委員會章程》的相關規(guī)定，實驗動物倫理審查批準（倫理審批號：DWLL20151108003）。

1.1.2?藥物?腸愈寧顆粒的配制腸愈寧顆粒由黃連、苦參、白頭翁、椿根皮、白芍、炒白術、當歸組成，由天江藥業(yè)提供，系取固定基源、產(chǎn)地、規(guī)格、等級的道地藥材，按中華人民共和國藥典2015年版，采用水浸提法，經(jīng)過濾、濃縮、噴霧干燥和制粒而成。

1.1.3?試劑與儀器?無水乙醇（天津永大化學試劑有限公司，批號：20130508）;三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma公司，美國，批號：SLBK1620V）;美沙拉嗪（愛的發(fā)制藥集團，法國，批號：C14200623779）;蘇木素-伊紅（HE）染色液（南京建成生物科技有限公司，批號：618111）;高速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司，型號：KDC-16H）;熒光倒置顯微鏡（尼康公司，日本，型號：Y-FL 076652）;生物組織切片機（湖北歐美萊醫(yī)療科技有限責任公司，中國，OmL-QPA型）;微量分析天平（Sartorius公司，德國，型號：BSA224S-CW）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?UC動物模型的建立及給藥48只雄性Wistar大鼠平均分成6組：空白對照組、模型組、腸愈寧高劑量組、腸愈寧中劑量組、腸愈寧低劑量組、美沙拉嗪對照組。除空白對照組給予等量生理鹽水灌胃，其余各組大鼠禁食24 h后，以10%水合氯醛（4.0 mL/kg）腹腔注射麻醉，直徑0.4 mm軟管用石蠟油潤滑，緩慢插入直腸，注入5%TNBS 50 mg/kg+50%乙醇0.25 mL，然后將大鼠尾部提起倒置60 s。清醒后，自由飲水，造模后連續(xù)1周從體質(zhì)量變化、大便性狀、內(nèi)臟敏感性、結腸病理等方面進行模型評價。造模7 d后隨機抽取2只大鼠解剖，根據(jù)結腸組織病理切片觀察到組織損傷變化，如有潰瘍性結腸炎病理變化，提示造模成功，造模前后均給予大鼠高脂飲食。

1.2.2?給藥方法?除空白對照組和模型組外所有的觀察組均于造模次日（即第8天）給予相應藥物灌胃，給藥1次/d，連續(xù)14 d。腸愈寧高劑量組、腸愈寧中劑量組、腸愈寧低劑量組分別灌服相當于生藥量為1 g/mL、2 g/mL、4 g/mL的腸愈寧顆粒溶液10 mL/kg。美沙拉嗪對照組灌服相當于生藥量為0.2 g/kg MES懸濁液10 mL/kg。而空白對照組、模型組給予等量10 mL/kg生理鹽水灌胃。于末次給藥（即第31天）處死大鼠取材并進行疾病活動指數(shù)（Disease Activity Index，DAI）評分。

1.2.3?檢測指標與方法

1.2.3.1?一般情況及DAI評分?對大鼠進行處死之前，觀察其精神狀態(tài)、活動情況、毛發(fā)程度、糞便、體質(zhì)量等情況并進行記錄。參照文獻評分標準[11]：DAI=（體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù)）/3，對各組小鼠進行DAI評分，以評估疾病活動情況，評分越高則表示炎性反應越重。具體評分如下：體質(zhì)量變化百分率（體質(zhì)量不變?yōu)?，1～5為1分，5～10為2分，10～15為3分，大于15為4分）、大便性狀（正常狀態(tài)為0，性狀松散為2分，腹瀉為4分）和大便隱血（正常0分，隱血狀態(tài)為2分，肉眼血便為4分）。

1.2.3.2?結腸長度變化及結腸黏膜損傷指數(shù)（Colon Macroscopic Damage Index，CMDI）評分?處死大鼠，沿縱軸剪開腸腔，取出大鼠全段結腸，予生理鹽水洗凈并且平鋪于濾紙上固定，測量長度并記錄。使用放大鏡肉眼觀察黏膜損傷情況，依據(jù)下面的評分標準進行大體評分[12]：結腸無損傷為0分;黏膜充血、水腫，未出現(xiàn)潰瘍?yōu)?分;黏膜充血、水腫伴隨輕度糜爛，未出現(xiàn)潰瘍?yōu)?分;黏膜充血、水腫伴隨中度糜爛，伴有單個潰瘍?yōu)?分;黏膜充血、水腫伴隨高度糜爛，伴有多個潰瘍?yōu)?分;黏膜充血、水腫伴隨重度糜爛，伴有>1 cm的潰瘍?yōu)?分。

1.2.3.3?HE染色觀察結腸變化及組織損傷指數(shù)評分（Tissue Damage Index，TDI）?在大鼠結腸部位剪取約0.5 mm×2.0 mm大小組織條，置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定24 h，經(jīng)乙醇脫水及二甲苯透明后進行石蠟包埋，連續(xù)切片5張，HE染色，光學顯微鏡觀察結腸組織黏膜變化。記錄結腸組織炎性反應、損傷程度和潰瘍面積。HE染色病理評分標準參照以下標準進行評分[13]：炎性反應程度，無炎性反應，0分;輕度炎性反應，1分;重度炎性反應，2分。病變深度：無病變，0分;病變侵及黏膜下層，1分;病變侵及肌層，2分;病變侵及漿膜層，3分。隱窩損傷：無損傷，0分;基底1/3隱窩被破壞，1分;基底2/3隱窩被破壞，3分;全部隱窩和上皮被破壞，4分。病理評分=炎性反應+病變深度+隱窩損傷評分。

1.2.3.4?ELISA血清檢測?治療結束后，各個分組的大鼠禁食24 h后稱其體質(zhì)量，麻醉后采用腹主動脈法采集大鼠全血于促凝管中，靜置2 h后3 500 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，分離血清后按照試劑說明書檢測血清中白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-4（IL-4）水平。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。當資料滿足正態(tài)分布且組間方差齊同時，應用單因素方差分析;如不滿足上述條件則采用非參數(shù)檢驗（秩和檢驗）方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?UC大鼠的一般情況和DAI評分?空白對照組大鼠的評分為0并且一般狀況良好，表現(xiàn)為反應快，毛發(fā)光滑，二便情況和體質(zhì)量正常等。而模型組表現(xiàn)為反應遲鈍，行動遲緩，毛色灰暗，糞便黏液狀且有隱血及血便的情況，體質(zhì)量下降。腸愈寧高劑量組和腸愈寧中劑量組以及美沙拉嗪組大鼠在用藥后情況有明顯好轉，逐漸恢復與空白對照組大鼠性狀相似，表現(xiàn)為精神狀況，毛發(fā)，糞便及體質(zhì)量均恢復正常。腸愈寧低劑量組大鼠在用藥后在精神狀況，毛發(fā)，糞便及體質(zhì)量等方面均有好轉，但是效果不如其他3組明顯（P<0.05）。按照規(guī)定的評分標準給予評分。見表1。

2.2?對UC大鼠結腸長度及大體形態(tài)評分的影響?所有分組的大鼠在給藥1周后處死，取結腸組織部位觀察并且測量結腸長度并記錄。與空白對照組比較并且在肉眼觀察下，模型組部分組織與結腸有粘連，明顯可見結腸黏膜充血水腫且伴有糜爛甚至出血，病灶部位結腸長度明顯縮短，大體形態(tài)評分增高。與模型組比較，腸愈寧高劑量組、腸愈寧中劑量組和美沙拉嗪組大鼠有明顯好轉，少見充血水腫，基本未見糜爛及出血且結腸長度較長，大體形態(tài)評分降低。腸愈寧低劑量組表現(xiàn)為部分組織與結腸有粘連，有部分結腸黏膜充血水腫且伴有糜爛甚至出血，結腸長度僅長于模型組。見表2。

2.3?腸愈寧顆粒對UC大鼠HE染色結腸組織及TDI的影響?空白對照組大鼠結腸黏膜完整，腺體排列整齊，黏膜下組織無損傷，無其他表現(xiàn)。模型組與空白對照組比較，腸黏膜損失重，腸黏膜下組織破損且明顯出現(xiàn)潰瘍及糜爛現(xiàn)象，病理評分升高。腸愈寧高劑量組和腸愈寧中劑量組以及美沙拉嗪對照組大鼠在給藥治療后黏膜病理變化明顯減輕，病理評分降低。腸愈寧低劑量組大鼠病理變化稍有好轉，病理變化僅強于空白對照組，病理評分僅高于空白對照組。見圖1、表3。

2.4?腸愈寧顆粒對UC大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-4表達的影響?與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α表達顯著升高，抗炎因子IL-4的表達明顯降低。腸愈寧高劑量組、腸愈寧中劑量組和美沙拉嗪對照組大鼠IL-4含量明顯高于模型組，IL-1β、TNF-α含量較模型組顯著下降。見圖2。

3?討論

潰瘍性結腸炎是指由多種原因引起的結腸炎性反應性病變。其發(fā)病原因是多方面的，可以由細菌、真菌、病毒、寄生蟲等生物引起[14]。目前治療UC的藥物如：潑尼松、潑尼松龍。上述藥物均存在停藥后易復發(fā)、長期使用不良反應大的問題。一些西藥在治療疾病的過程中還會造成結腸內(nèi)菌群紊亂，導致菌群的嚴重失衡進而加重病情。在用藥或者手術中保留灌腸的方式，患者的依順性很差治療過程痛苦麻煩。中醫(yī)中藥經(jīng)過臨床實踐，通過對UC辨證分型論治，在臨床中取得較好療效，疾病復發(fā)率低，不良反應，所以臨床上使用中醫(yī)藥治療的患者越來越多，特別是早期和慢性UC患者，因此近幾年，中藥治療潰瘍性結腸炎逐漸引起了重視。

腸愈寧方由黃連、苦參、白術、白頭翁、椿根皮、白芍、當歸7味藥物組成，從中醫(yī)角度來說潰瘍性結腸炎是濕熱下注大腸，搏結氣血，釀為膿血，腸道氣滯則腹痛、里急后重、下痢赤白黏凍，肛門灼熱;小便短赤，苔多黃膩，脈象弦數(shù)等而顯現(xiàn)的濕熱內(nèi)蘊之象。腸愈寧方中黃連、白頭翁性味苦寒，功擅清熱燥濕解毒，以除致病之因，入大腸經(jīng)，為君藥?？鄥?、椿根皮祛濕涼血助君藥清濕熱積滯，為臣藥。芍藥養(yǎng)血斂陰，配以當歸活血，體現(xiàn)了“行血則便膿自愈”之義。白術味甘、微苦，健脾益氣，補中燥濕，止渴生津，最益脾精，大養(yǎng)胃氣，升清陽而消水谷，能醫(yī)泄痢，三者共為佐藥。腸愈寧方可有效改善患者免疫功能和腸道運動功能，療效良好，具有清熱解毒、燥濕健脾功效，患者的臨床癥狀能夠得到有效的改善，同時也能夠促進患者機體內(nèi)平衡的穩(wěn)定，且患者復發(fā)狀況能夠明顯減少，所以，進一步研究腸愈寧顆粒治療UC的作用機制是很有意義的。

本研究采用三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇復合灌腸法建立UC大鼠模型，造模1周后，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠首先在性狀方面發(fā)生變化，表現(xiàn)為反應遲鈍、懶動、毛色晦暗、體質(zhì)量減輕、糞便出現(xiàn)隱血甚至出現(xiàn)便血的情況。取出大鼠結腸部分觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結腸長度縮短并且和部分組織有粘連，結腸黏膜出現(xiàn)充血水腫，經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)結腸黏膜受損嚴重，結腸黏膜下組織出現(xiàn)潰瘍且糜爛的現(xiàn)象。而在使用腸愈寧顆粒中劑量或高劑量后可明顯改善這些癥狀，大鼠呈現(xiàn)活潑好動、毛色光澤、糞便正常以及體質(zhì)量減輕明顯好轉的趨勢，此外，腸愈寧高劑量和中劑量組大鼠結腸黏膜充血水腫的癥狀明顯好轉，潰瘍和糜爛的程度減輕，結腸黏膜受損修復，DAI、CMDI和TDI評分顯著下降。該結果表明腸愈寧顆粒對潰瘍性結腸炎大鼠有一定的治療作用。

IL-1β是一種由單核巨噬細胞產(chǎn)生的致炎因子，Cao等[15]認為UC的發(fā)生可能是由于IL-1β誘導H2O2的釋放，從而影響Ca2+的釋放，導致UC患者結腸平滑肌功能障礙。TNF-α是一種促炎遞質(zhì)，參與體內(nèi)的細胞免疫反應[16]，可被看作是評估UC嚴重程度的指標[17]?？寡滓蜃覫L-4是II型輔助T細胞（Th2細胞）分泌的細胞因子，Mittal等[18]認為在維持腸道免疫以及抑制和消除腸道炎性反應方面，IL-4起著關鍵作用。在本實驗研究過程中我們發(fā)現(xiàn)，IL-1β、TNF-α、IL-4的表達水平高低是根據(jù)分組的用藥情況來不斷變化的，模型組大鼠在經(jīng)TNBS誘導后，TNF-α和IL-1β的含量明顯上升，IL-4的含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。同模型組比較，在腸愈寧高劑量組、腸愈寧中劑量組和美沙拉嗪對照組的UC大鼠生存條件明顯改善，大鼠血清中TNF-α和IL-1β蛋白的表達水平顯著降低，IL-4表達升高，尤其以高劑量組腸愈寧顆粒的作用顯著。這表明UC的發(fā)展和產(chǎn)生與腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-1β（IL-1β）3種蛋白的表達有密切的關系，也揭示了腸愈寧顆粒治療UC的機制可能是通過非選擇性抑制TNF-α和IL-1β的表達并且提高IL-4的表達從而增加其抗炎效果來實現(xiàn)的。

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（2020-03-17收稿?責任編輯：王明）