吳灃 彭金香

摘要?目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究燈盞細(xì)辛膠囊治療缺血性腦卒中的藥理機(jī)制。方法：采用TCMSP等檢索燈盞細(xì)辛膠囊的活性成分，并且得到其燈盞細(xì)辛膠囊活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn);然后通過(guò)PharmGKB、Genecards2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)，使用METASCAPE軟件對(duì)兩者取交集的49個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析。采用Cytoscape 3.7.1軟件建立活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型。結(jié)果：燈盞細(xì)辛膠囊可能通過(guò)補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、核因子-κB信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等多個(gè)通路治療缺血性腦卒中。結(jié)論：燈盞細(xì)辛膠囊體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為進(jìn)一步闡釋燈盞細(xì)辛膠囊治療缺血性腦卒中的藥理機(jī)制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);燈盞細(xì)辛膠囊;缺血性腦卒中;黃芩素;槲皮素;毛地黃黃酮;山柰酚;信號(hào)通路

Abstract?Objective：To study the pharmacological mechanism of Dengzhan Xixin Capsule in the treatment of ischemic stroke by network pharmacology.Methods：The active components of Dengzhan Xixin Capsules were retrieved by TCMSP and the corresponding targets were obtained.Then，through PharmGKB and Genecards，the 2 databases were used to search for ischemic stroke-related targets，and METASCAPE software was used to perform GO annotation analysis and KEGG pathway analysis on the 49 targets where the 2 intersect.Cytoscape 3.7.1 software was used to establish the active ingredient-target-channel network model.Results：Dengzhan Xixin Capsules may treat ischemia through multiple pathways such as complement and coagulation cascade pathway，HIF-1 signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，F(xiàn)oxO signaling pathway，NF-kappa B signaling pathway，and adipokine signaling pathway.Conclusion：Dengzhan Xixin Capsules embody the characteristics of multiple ingredients，multiple targets and multiple pathways of traditional Chinese medicine，which provides a theoretical basis for further elucidating the pharmacological mechanism of Dengzhan Xixin Capsules in the treatment of ischemic stroke

Keywords?Network pharmacology; Dengzhan Xixin Capsules; Ischemic stroke; Baicalein; Quercetin; Luteolin; Kaempferol; Signal pathway

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.17.008

中藥在治療缺血性腦卒中（Cerebral Ischemic Stroke，CIS）方面具有多組分，多靶點(diǎn)，整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)，已成為防治缺血性腦卒中的重要組成部分。燈盞細(xì)辛膠囊是由燈盞細(xì)辛組成。具有活血化瘀的作用。燈盞細(xì)辛膠囊的藥理學(xué)機(jī)制包括降低血液黏稠度，抑制血小板聚集，抗缺血及灌注損傷，清除氧自由基、抗氧化，改善腦微循環(huán)及器官血流動(dòng)力學(xué)等多方面作用等[1-2]。多靶點(diǎn)傳統(tǒng)中藥可能對(duì)缺血性腦卒中更有效。燈盞細(xì)辛膠囊的功效已經(jīng)在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，燈盞細(xì)辛膠囊治療缺血性腦卒中的機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種系統(tǒng)的方法，能夠幫助分析傳統(tǒng)中藥和疾病之間的藥理數(shù)據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將生物學(xué)特征與化學(xué)結(jié)構(gòu)特征聯(lián)系起來(lái)，并組建網(wǎng)絡(luò)模型，有助于深入分析涉及藥物藥理作用的成分[3]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法能幫助我們對(duì)中成藥燈盞細(xì)辛膠囊所涵蓋的多個(gè)層次作用進(jìn)行分析。我們擬構(gòu)建燈盞細(xì)辛膠囊-靶標(biāo)-缺血性腦卒中的網(wǎng)絡(luò)，對(duì)燈盞細(xì)辛膠囊多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特征進(jìn)行系統(tǒng)研究，并揭示中成藥燈盞細(xì)辛膠囊治療缺血性腦卒中的藥理作用及其作用機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?化學(xué)成分信息?通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php）[4]和PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/），分別檢索燈盞細(xì)辛膠囊的化學(xué)成分。以口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.2為限定條件，篩選燈盞細(xì)辛膠囊的化學(xué)成分-靶點(diǎn)信息。CIS相關(guān)靶點(diǎn)的獲從PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）、Genecards（https：//www.genecards.org/）2個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索[5-6]。

1.2?網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析?使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）進(jìn)行蛋白名與基因名轉(zhuǎn)換，將中成藥燈盞細(xì)辛膠囊和CIS矯正后的基因取交集。將燈盞細(xì)辛膠囊中候選出的化合物和CIS靶標(biāo)導(dǎo)入cytoscape軟件，進(jìn)行燈盞細(xì)辛膠囊中候選出的化學(xué)成分-燈盞細(xì)辛膠囊與CIS交集基因-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。通過(guò)cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)分析燈盞細(xì)辛膠囊治療CIS多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)[7]。

1.3?交集靶點(diǎn)及通路注釋分析?利用METASCAPE（http：//metascape.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的交集基因進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析[8]。

2?結(jié)果

2.1?化學(xué)成分和靶點(diǎn)基因的收集?檢索得到燈盞細(xì)辛膠囊中符合限定條件的化學(xué)成分（表1），并刪除燈盞細(xì)辛膠囊化學(xué)成分中木犀草素（luteolin）所對(duì)應(yīng)的16個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)基因。最終選出燈盞細(xì)辛膠囊的化學(xué)成分對(duì)應(yīng)186個(gè)基因，包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）、3β羥基類(lèi)固醇脫氫酶/δ5-4異構(gòu)酶1型（HSD3B1）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等。

2.2?CIS相關(guān)靶點(diǎn)信息?從2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到CIS相關(guān)基因312個(gè)，包括亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）、血管緊張素Ⅱ1型受體（AGTR1）、花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白（ALOX5AP）等。

2.3?交集基因的生物分子功能注釋?將燈盞細(xì)辛膠囊靶點(diǎn)基因和CIS的相關(guān)基因取交集，共有49個(gè)相關(guān)基因，包括MMP2、HSPB1、COL3A1、SERPINE1、PLAU、VCAM1、HMOX1、CYCS、NOS2、EGF、MMP3、MPO、AKT1、IL10、SPP1、PTGS2、PLAT、IL1B、SOD1、ESR1、PON1、IFNG、IL4等。對(duì)燈盞細(xì)辛膠囊和CIS的49個(gè)交集基因通過(guò)METASCAPE系統(tǒng)進(jìn)行生物分子功能注釋。交集基因在分子功能主要是對(duì)細(xì)胞因子受體結(jié)合、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等功能，包括、CASP、CD40LG、IFNG、IL1B、IL4、IL6、CXCL8、IL10、CCL2等基因。交集基因主要分布在膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)等部位，包括ACHE、COL3A1、F3、ICAM1、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、SERPINE1、PLAT、VEGFA等。交集基因主要參與細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)控等生物過(guò)程。AKT1、BCL2、BCL2L1、CASP3、CD40LG、F3、HMOX1、IFNG等基因參與其中。見(jiàn)表2。

2.4?采用Cytoscape軟件構(gòu)建燈盞細(xì)辛膠囊中候選出的化學(xué)成分-燈盞細(xì)辛膠囊與CIS交集基因-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建?由KEGG分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到5條通路。見(jiàn)表3。作用于靶點(diǎn)和通路的化學(xué)成分有黃芩素、槲皮素、毛地黃黃酮、山柰酚、芒柄花黃素等。其中黃芩素作用于BCL2、AKT1、MPO、CYCS、MMP9、CASP3、VEGFA、HIF1A。槲皮素作用于CD40LG、PON1、CRP、SPP1、NFE2L2、COL3A1、PLAT、THBD、SERPINE1、IFNG、F3、IL1B、CCL2、CXCL8、NOS3、HSPB1、IL6、ODC1、SOD1、BCL2L1、PLAU、MMP2、IL10、EGF、MMP3，毛地黃黃酮作用于APP，山柰酚作用于VCAM1、MMP1、HMOX1、ICAM1、SELE、F7，芒柄花黃素作用于PPARG、IL4、ACHE、NOS2、ESR1、PPARG、PTGS2、SLC6A3、ADRB。燈盞細(xì)辛膠囊主要活性成分的靶點(diǎn)涉及較多的通路有補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、核因子-κB信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路。

3?討論

燈盞細(xì)辛膠囊已經(jīng)在臨床上應(yīng)用于治療CIS[9-11]。但目前對(duì)燈盞細(xì)辛膠囊治療CIS的藥理機(jī)制尚不明確。早期研發(fā)的藥物主要尋求與特定疾病特定靶標(biāo)的相關(guān)，開(kāi)發(fā)一種新藥需要長(zhǎng)達(dá)15～20年[12]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路，能更好反映出中醫(yī)整體觀。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠從分子和細(xì)胞水平到組織和生物體水平分析燈盞細(xì)辛膠囊化學(xué)成分，CIS靶標(biāo)和CIS之間的聯(lián)系，并能探索燈盞細(xì)辛膠囊治療缺血性腦卒中的作用靶點(diǎn)、通路及其作用機(jī)制。

我們對(duì)燈盞細(xì)辛膠囊進(jìn)行成分和靶點(diǎn)分析，收集CIS的相關(guān)基因，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，得到燈盞細(xì)辛膠囊的化學(xué)成分中黃芩素作用于8個(gè)CIS靶點(diǎn)，槲皮素作用于25個(gè)CIS靶點(diǎn)，毛地黃黃酮作用于1個(gè)CIS靶點(diǎn)，山柰酚作用于6個(gè)CIS靶點(diǎn)，芒柄花黃素作用于9個(gè)CIS靶點(diǎn)。通過(guò)燈盞細(xì)辛膠囊和CIS交集基因的相關(guān)通路，預(yù)測(cè)燈盞細(xì)辛膠囊通過(guò)黃芩素、槲皮素、毛地黃黃酮、山柰酚、芒柄花黃素等多個(gè)化學(xué)成分作用于補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、核因子-κB信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等多個(gè)信號(hào)通路。其中，馬新建等[13]發(fā)現(xiàn)燈盞花素能降低急性缺血性腦血管病患者的HIF-1α。燈盞花素能夠減弱腦外傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元自噬和炎性損傷，這一作用可能通過(guò)抑制TLR4/核因子-κB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)[14]。趙燕等[15]發(fā)現(xiàn)燈盞花素能抑制糖尿病大鼠腎臟肥大，發(fā)揮保護(hù)腎功能。進(jìn)一步支持本研究的通路結(jié)果。

總之，此研究表明燈盞細(xì)辛膠囊其化學(xué)成分可能直接作用于CIS關(guān)鍵的通路和靶點(diǎn)。但本研究中燈盞細(xì)辛膠囊治療CIS的關(guān)鍵通路和靶點(diǎn)仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]許春立，徐敉，顧育明.依達(dá)拉奉聯(lián)合燈盞花素注射液治療急性缺血性腦血管病的臨床研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2018，16（11）：1490-1493.

[2]朱維強(qiáng)，施興華.燈盞花素對(duì)LI患者的效果及血液流變學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)的影響[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2018，36（5）：620-623.

[3]Yuan H，Ma Q，Cui H，et al.How Can Synergism of Traditional Medicines Benefit from Network Pharmacology？[J].Molecules，2017，22（7）：1135.

[4]Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6：13.

[5]Huddart R，Leeder JS，Altman RB，et al.PharmGKB summary：clobazam pathway，pharmacokinetics[J].Pharmacogenet Genomics，2018，28（4）：110-115.

[6]Stelzer G，Rosen N，Plaschkes I，et al.The GeneCards Suite：From Gene Data Mining to Disease Genome Sequence Analyses[J].Curr Protoc Bioinformatics，2016，54：1.30.1-1.30.33.

[7]Demchak B，Hull T，Reich M，et al.Cytoscape：the network visualization tool for GenomeSpace workflows[J].F1000Res，2014，3：151.

[8]張晶晶，趙拯，劉赟心，等.基于基因表達(dá)譜篩選乳腺癌他莫昔芬耐藥的生物標(biāo)志物與治療藥物[J].臨床與病理雜志，2018，38（7）：1392-1398.

[9]王傳頌，李龍杰.燈盞花素聯(lián)合依達(dá)拉奉治療缺血性腦卒中臨床觀察[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2018，34（7）：815-816.

[10]苗建國(guó)，陳淑敏.燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合胞磷膽堿鈉膠囊治療腦梗死的臨床研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2016，31（1）：41-44.

[11]宋禮.燈盞花素聯(lián)合波立維對(duì)腦梗塞患者血流變的影響及療效觀察[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2018，24（3）：394-396.

[12]Engin HB，Gursoy A，Nussinov R，et al.Network-based strategies can help mono-and poly-pharmacology drug discovery：a systems biology view[J].Curr Pharm Des，2014，20（8）：1201-1207.

[13]馬新建，盧連偉，高立玲.燈盞花素對(duì)急性缺血性腦血管病患者血清copeptin、NT-proBNP、HIF-1α及IMA影響研究[J].中國(guó)生化藥物雜志，2015，35（7）：119-121.

[14]楊麗梅，顧軍，林明建，等.燈盞花素的研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2010，22（1）：56-60.

[15]趙燕，楊秋萍，劉華，等.燈盞花素對(duì)糖尿病大鼠腎臟PI3K/AKT傳導(dǎo)通路的影響[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（11）：58-62.

（2019-03-29收稿?責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）