柳丙玲，秦雪瑩，曲 藝，韓 通

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 制藥工程系，黑龍江 大慶 163319)

燈盞乙素，是從菊科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz的干燥全草中分離得到的一種黃酮苷類化合物[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，燈盞乙素具有心血管保護(hù)活性、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[2]。臨床上常作為主要有效成分，用于治療心血管類疾病。近年來，燈盞乙素的抗腫瘤功能的研究與開發(fā)日益受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素可以通過多種途徑來發(fā)揮抗癌作用。主要包括，燈盞乙素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性和增加腫瘤對藥物的敏感性等[3-6]。此外，燈盞乙素的藥理毒理實(shí)驗(yàn)表明，燈盞乙素即使較高的給藥劑量下，對動物的毒性也較低[7]。進(jìn)一步表明燈盞乙素具有較好的選擇性。但燈盞乙素的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，體內(nèi)易代謝，生物利用度低的問題，限制其進(jìn)一步的開發(fā)[8]?？蒲腥藛T嘗試在其羧基部位成酯，獲得了多種燈盞乙素酯類衍生物，發(fā)現(xiàn)這些衍生物的藥代性質(zhì)得到了一定的改善，但仍不是很穩(wěn)定[9-10]。為了進(jìn)一步提高燈盞乙素的穩(wěn)定性和抗腫瘤活性，本研究擬合成燈盞乙素的酰胺類衍生物，選取多種脂肪胺，進(jìn)行縮合，成酰胺鍵。此外，甲氧基是黃酮類天然產(chǎn)物中較為常見的活性基團(tuán)，很多含有甲氧基的黃酮類化合物均具有較好的生物活性，因此，我們引入甲基于燈盞乙素的4'-OH和6-OH處。，綜上，本研究合成了燈盞乙素酰胺類衍生物，并選取對燈盞乙素較為敏感的人白血病細(xì)胞株HL-60和THP-1，測試了目標(biāo)化合物的體外抗增殖活性測試。

1 結(jié)果與討論

1.1 合成及結(jié)構(gòu)解析

本文以市售的燈盞乙素為原料，經(jīng)三步化學(xué)反應(yīng)，合成目標(biāo)化合物4a-d。首先，以碘甲烷為甲基化試劑，于燈盞乙素結(jié)構(gòu)中的4'-OH、6-OH和糖羧基位置上甲基，得到甲基化燈盞乙素中間體2。進(jìn)一步經(jīng)醇鈉水解，脫去糖羧基上的甲基保護(hù)基，得到羧基裸露的中間體3。選取多種脂肪胺，包括丙胺、異丙胺、己胺和環(huán)己胺，在縮合劑HOBt和EDCI的條件下，與中間體3室溫反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物4a-d。并通過1H-NMR和HR-MS對目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。以化合物4a的波譜數(shù)據(jù)為例，進(jìn)行分析。在1H-NMR譜中，δ12.92單峰為結(jié)構(gòu)中5-OH信號；δ8.08和7.13附近出現(xiàn)雙峰且耦合常數(shù)相同，歸屬為結(jié)構(gòu)中B環(huán)的2'，6'和3'，5'的信號氫；δ7.04和6.97為單峰，分別歸屬為結(jié)構(gòu)中A環(huán)8位和C環(huán)的3位上信號氫；δ5.52、5.22、5.15和3.91，表現(xiàn)為寬單峰或雙峰，為糖上的醇羥基和糖上脂肪烴氫信號；4'和6位甲氧基的信號也很明顯，分別為δ3.87和3.77的單峰；丙胺的兩個亞甲基的信號為δ3.04和1.41附近的多重峰，甲基在δ0.79處顯示三重峰。在高分辨質(zhì)譜中，HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741，found 554.1650，表明分子量正確。綜上，可以確認(rèn)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)的正確性。

1.2 衍生物4a-d的抗白血病細(xì)胞株增殖活性

選取人白血病細(xì)胞株HL-60和THP-1，采用臺盼藍(lán)染色法測試了目標(biāo)化合物4a-d的體外抗腫瘤細(xì)胞株增殖活性，具體結(jié)果見表1。表中數(shù)據(jù)結(jié)果表明，燈盞乙素酰胺衍生物4a-d，對兩株細(xì)胞株都具有抗增殖活性?；衔?b-d對THP-1的IC50值明顯低于燈盞乙素；4b和4d對HL-60的抑制能力與燈盞乙素相當(dāng)；化合物4a對兩株細(xì)胞株的抑制活性均與燈盞乙素相差不大。其中化合物4c對兩株細(xì)胞株的抑制能力最強(qiáng)，其IC50分別為4.21和5.76μM，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

表1 目標(biāo)化合物4a-d體外抗白血病細(xì)胞 株HL-60和THP-1增殖活性

2 結(jié)論

本文共合成了四個結(jié)構(gòu)全新的燈盞乙素酰胺類衍生物4a-d，并采用臺盼藍(lán)染色法，對所合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行體外抗白血病細(xì)胞株活性測試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明燈盞乙素酰胺衍生物對HL-60和THP-1細(xì)胞株都具有一定的抗增殖作用。部分化合物對THP-1細(xì)胞株的抑制能力強(qiáng)于先導(dǎo)化合物燈盞乙素。其中化合物4c對兩株細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，并明顯強(qiáng)于燈盞乙素。以上結(jié)果，為燈盞乙素的進(jìn)一步抗腫瘤研究奠定基礎(chǔ)。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：Bruker-ARX-300型和Bruker-AV-600型(TMS作內(nèi)標(biāo))核磁共振光譜儀。日本島津GCMS-5050A氣質(zhì)聯(lián)用儀；Agilent 1100離子阱型液-質(zhì)聯(lián)用儀。

實(shí)驗(yàn)材料：燈盞乙素(純度98%，南京澤朗生物科技有限公司)；柱色譜分離采用硅膠H或硅膠(200～300目)，薄層色譜用硅膠GF254，均采購于青島海洋化工廠；其他試劑與化學(xué)原料均為化學(xué)純或分析純。

3.2 實(shí)驗(yàn)方法

3.2.1 中間體2的合成

取燈盞乙素(1.39g，3mmol)，溶于DMF(10mL)中，加入碘甲烷(1.12mL，18mmol)和DBU(2.3mL，15mmol)，室溫?cái)嚢?，反?yīng)24 h后終止反應(yīng)。將反應(yīng)液傾入100 mL冰水混合物中，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，飽和食鹽水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，經(jīng)硅膠柱色譜分離，得淡黃色固體635mg，收率41.9%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.96 (s,1H,5-OH),8.03 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.55 (d,2H,J = 7.0 Hz,Ar-H),7.48 (d,2H,J = 7.4 Hz,Ar-H),7.36 (m,9H,Ar-H),7.25 (d,2H,J = 7.0 Hz,Ar-H),7.20 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.12 (s,1H,H-8),6.95 (s,1H,H-3),5.66 (d,1H,J=5.3 Hz,H-1),5.57 (d,1H,J = 5.7 Hz,sugar hydroxyl),5.43 (d,1H,J=7.4 Hz,sugar hydroxyl),5.37 (d,1H,J = 5.3 Hz,sugar hydroxyl),5.24 (s,2H,-CH2-),5.17(d,2H,J = 11.9Hz,-CH2-),5.02 (d,2H,J = 10.9 Hz,-CH2-),4.29 (d,1H,J = 9.6 Hz,H-5 ),3.53-3.40 (m,3H,H2,3,4);MS(ESI) m/z733.2[M+H]+。

3.2.2 中間體3的合成

取化合物2(504mg，1mmol)，溶于二氯甲烷/醇溶液中(32mL),滴加甲醇鈉(2～3mL)，室溫反應(yīng)8-12h。濃縮，加入水(10mL)，調(diào)pH值至3-5，抽濾，烘干，得黃色固體461mg，收率94.1%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm):12.94 (s,1H,5-OH),8.06 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.15 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.09 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.61 (s,1H,H-1 ),5.50 (s,1H,sugar hydroxyl),5.37 (s,1H,sugar hydroxyl),5.33 (d,1H,J = 7.0 Hz,sugar hydroxyl),4.21 (d,1H,J = 9.4 Hz,H-5 ),3.87 (s,3H,-OCH3),3.76 (s,3H,-OCH3),3.66 (s,3H,-OCH3),3.48-3.35 (m,3H,H-2 ,3 ,4 );MS(ESI) m/z: 491.1[M+H]+。

3.2.3 目標(biāo)化合物4a-d的合成

取中間體3(60mg，0.12mmol)，HOBt(20mg，0.14mmol)，EDCI(46 mg，0.24mmol)溶于DMF中(2mL)，攪拌至完全溶解。加入相對應(yīng)的脂肪胺(0.14mmol)，室溫避光反應(yīng)2h。將反應(yīng)液傾入20mL冰水混合物中，用乙酸乙酯萃取(20 mL×3)，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，經(jīng)硅膠柱分離，得到燈盞乙素酰胺類衍生物4a-d。

目標(biāo)化合物4a，黃色粉末，收率61.9%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.92 (s,1H,5-OH),8.08 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-2 ,6 ),8.01 (t,1H,J = 5.6 Hz,-NH-),7.13 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-3 ,5 ),7.04 (s,1H,H-8),6.97 (s,1H,H-3),5.52 (brs,1H,H-1 ),5.22 (brs,1H,sugar hydroxyl),5.15 (d,1H,J = 7.5 Hz,sugar hydroxyl),3.91 (d,1H,J = 9.7 Hz,H-5),3.87 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52-3.42 (m,3H,H-2,3,4 ),3.04 (m,2H,-CH2-),1.41 (m,2H,-CH2-),0.79 (t,3H,J = 7.4 Hz,-CH3); HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741,found 554.1650。

目標(biāo)化合物4b，黃色粉末，產(chǎn)率49%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.91 (s,1H,5-OH),8.09 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-2 ,6 ),7.94 (m,1H,-NH-),7.12 (d,2H,J = 8.9 Hz,H-3 ,5 ),7.05 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.52 (brs,1H,H-1 ),5.24 (brs,1H,sugar hydroxyl),5.10 (d,1H,J = 7.6 Hz,sugar hydroxyl),3.87 (s,3H,-OCH3),3.82 (d,1H,J = 7.1 Hz,H-5 ),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52 (m,1H,-CH-),3.39-3.37 (m,3H,H-2 ,3 ,4 ),1.08 (d,3H,J = 6.5 Hz,-CH3),1.03 (d,3H,J = 6.5 Hz,-CH3); HR-MS (ESI) m/z calcd for C26H29NO11[M+Na]+554.1741,found 554.1652。

目標(biāo)化合物4c，黃色粉末，產(chǎn)率36%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.91 (s,1H,5-OH),8.08 (d,2H,J = 8.7 Hz,H-2 ,6 ),8.00 (s,1H,-NH-),7.11 (d,2H,J = 8.7 Hz,H-3 ,5 ),7.03 (s,1H,H-8),6.96 (s,1H,H-3),5.54 (d,1H,J = 5.4 Hz,H-1 ),5.25 (d,1H,J = 5.1 Hz,sugar hydroxyl),5.22 (d,1H,J = 5.0 Hz,sugar hydroxyl),5.15 (d,1H,J = 7.3 Hz,sugar hydroxyl),3.91 (d,1H,J = 9.7 Hz,H-5 ),3.86 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.52-3.37 (m,3H,H-2,3,4),3.06 (m,2H,-CH2),1.36-1.05 (m,8H,-CH2-),0.66 (t,3H,J = 6.7 Hz,-CH3);HRMS (ESI) m/z calcd for C29H35NO11[M+Na]+596.2210,found 596.2195。

目標(biāo)化合物4d，黃色粉末，產(chǎn)率13%。1H-NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ (ppm): 12.90 (s,1H,5-OH),8.11 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-2 ,6 ),7.98 (d,1H,J = 8.5 Hz,-NH-),7.11 (d,2H,J = 9.0 Hz,H-3 ,5 ),7.08 (s,1H,H-8),6.97 (s,1H,H-3),5.53 (s,1H,H-1 ),5.25 (s,2H,sugar hydroxyl),5.08 (d,1H,J = 7.4 Hz,sugar hydroxyl),3.88 (s,1H,H-5 ),3.86 (s,3H,-OCH3),3.77 (s,3H,-OCH3),3.55-3.41 (m,3H,H-2 ,3 ,4 ),1.73-1.22 (m,11H,-CH2-,-CH3); HRMS (ESI) m/z calcd for C29H33NO11[M+Na]+594.2054,found 594.2123。

3.3 體外抗白血病細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用臺盼藍(lán)法測試目標(biāo)化合物4a-d的抗腫瘤活性。選取人白血病細(xì)胞株HL-60和THP-1在37 C、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10%熱滅活胎牛血清，青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基。48h更換培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期，臺盼藍(lán)拒染法表明細(xì)胞活力大于95%。

取對數(shù)生長期的受試細(xì)胞，以5×104cells/mL的密度接種于24孔板內(nèi)，每孔內(nèi)2mL。接種完畢后即加入相應(yīng)濃度的待測藥物。藥物處理72h后，從每孔的細(xì)胞懸液中吸取50μL細(xì)胞懸液，加入50μL的0.4%臺盼藍(lán)溶液中混勻，在3min內(nèi)，于光學(xué)顯微鏡下觀察，分別計(jì)數(shù)每孔的細(xì)胞總數(shù)。每孔中的總細(xì)胞數(shù)占對照孔總細(xì)胞數(shù)的百分比即為該濃度藥物的生長抑制率。