劉友強(qiáng),胡冀陶,李保坤,席金川,王貴英,2?

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外二科, 石家莊 050011; 2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院, 石家莊 050051)

結(jié)腸癌(colon cancer)是常見的惡性腫瘤,發(fā)病率位居全球第三位[1]。 隨著醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展,醫(yī)療水平取得了顯著提升,但結(jié)腸癌患者仍然呈現(xiàn)較高復(fù)發(fā)率[2-3]。 因此,有效的治療方法仍是臨床迫切需求的。 微小RNA(miRNA) 是長度為20 ～25個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA,可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)的表達(dá)[4]。 miR-424-5p 是miRNA 中的一員,研究報(bào)道,miR-424-5p 通過靶向ARK5 可抑制肝內(nèi)膽管癌的轉(zhuǎn)移和侵襲[5]。 一項(xiàng)關(guān)于肝癌轉(zhuǎn)移的研究發(fā)現(xiàn),miR-424-5p 異常表達(dá)與失巢凋亡和EMT 密切相關(guān), 且其下調(diào)明顯促進(jìn)了肝癌的進(jìn)展[6]。 還有研究顯示, miR-424-5p 可以通過下調(diào)BCL-2 的表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞A549 增殖[7]。 這些提示,miR-424-5p 可能在腫瘤中負(fù)性調(diào)控細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。 但也有研究報(bào)道m(xù)iR-424-5p 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。 一項(xiàng)喉鱗狀細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn),miR-424-5p 可通過介導(dǎo)CADM1 促進(jìn)細(xì)胞侵襲[8]。 而在結(jié)腸癌中,miR-424-5p 的生物學(xué)作用還不清楚,有待于進(jìn)一步研究。 本研究以結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞作為研究對(duì)象,通過外源性上調(diào)miR-424-5P 水平,觀察細(xì)胞增殖能力變化,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討,為臨床治療結(jié)腸癌提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清( fetal bovine serum,FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液( Phosphate Buffer solution,PBS)購自美國Gibco 公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購自美國MCE 公司;二甲基亞砜(DMSO) 和TRIzol 購自美國Sigma 公司;YAP抗體( 貨 號(hào)14074 )、 Phospho-YAP 抗 體( 貨 號(hào)53749)、Src 抗體( 貨號(hào)2109T)、 Phospho-Src 抗體(貨號(hào)12432S)、LATS1 抗體(貨號(hào)3477T)、Phospho-LATS1 抗體( 貨號(hào)8654S) 購自美國CST 公司;GAPDH 抗體(貨號(hào)abs830030)、抗兔IgG-HRP 二抗(貨號(hào)Abs20040)購自上海愛必信公司;總蛋白提取試劑盒、細(xì)胞裂解液、結(jié)晶紫染液購自上海碧云天公司; 聚偏二氟乙烯膜 ( PVDF ) 膜購自美國Millipore 公司;miR-424-5P 慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海吉?jiǎng)P基因公司;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)試劑盒購自美國Promega 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HT-29 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 和1%青-鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中,細(xì)胞置于37℃、5% CO2、95% 空氣的培養(yǎng)箱中。

1.3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染法上調(diào)miR-424-5P 水平

以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種HT-29 細(xì)胞于6 孔板中。 次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)染前稀釋病毒液,準(zhǔn)備兩管含10 μg / mL 聚凝胺的RPMI1640 培養(yǎng)基各1 mL,分別加入100 μL 重組miR-424-5P 基因慢病毒原液和空載病毒原液,混勻。 以上述混合液分別處理細(xì)胞,前者設(shè)為過表達(dá)組( miR-424-5P-OV組),后者設(shè)為空載體組(NC 組),同時(shí)以等量培養(yǎng)處理的細(xì)胞作為空白組( Blank 組),放置在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),24 h 后更換新鮮的RPMI1640 培養(yǎng)基,48 h 后傳代至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),嘌呤霉素篩選穩(wěn)定過表達(dá)miR-424-5P 的細(xì)胞株。

1.3.3 MTT 法檢細(xì)胞活力

將各組細(xì)胞按每孔9000 個(gè)接種于96 孔板中,每組6 個(gè)重復(fù)孔,72 h 后每孔直接加入20 μL MTT溶液(5 mg / mL),放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL,于酶標(biāo)儀上測定各孔490 nm 的吸光度值。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RTFQ-PCR)檢測miR-424-5P 水平

當(dāng)細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)收集各組細(xì)胞,采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA,并將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,稀釋反轉(zhuǎn)錄好的cDNA 至500 μL,充分混勻備用。 取出配制好的各引物,并按上游引物與下游引物1 ∶1稀釋,按SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒添加各試劑以準(zhǔn)備反應(yīng)體系,在ABI 7300型RTFQ-PCR 系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)置反應(yīng)條件:95℃10 s,95℃10 s,60℃60 s,共40 個(gè)循環(huán),每組設(shè)置6 個(gè)重復(fù)孔。 2-△△Ct法計(jì)算miR-424-5P 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成能力

待各組細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)消化細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液,以每孔500 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 d,吸出舊培養(yǎng)基,以固定液(4%多聚甲醛)固定10 min,PBS 洗兩遍,加入結(jié)晶紫染液染色15 min,雙蒸水洗去染液。 于倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù), 克隆形成率(%) = 克隆數(shù)/ 接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.6 免疫熒光檢測各組細(xì)胞YAP 核質(zhì)分布情況

各組細(xì)胞傳代于放好爬片的6 孔培養(yǎng)板中,24 h 時(shí)以固定液(4%多聚甲醛)固定15 min,室溫條件下以Triton X-100 處理10 min。 同時(shí)配制5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 的PBS 封閉液,封閉細(xì)胞2 h,于4℃條件下孵育YAP 一抗(1 ∶500)過夜,PBST 洗3 次,滴加稀釋好的熒光二抗(1∶300)避光孵育1 h,PBS 洗3 遍,DAPI 染色5 min,洗去后封片,倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.7 Western blot 法檢測各蛋白表達(dá)

配制RIPA 細(xì)胞裂解液(使用前RIPA,蛋白抑制劑,磷酸酶抑制劑,多種蛋白酶抑制劑按照100 ∶1:1 ∶1混合)并置于冰上備用,將各組細(xì)胞傳代至6 cm 培養(yǎng)皿,生長至對(duì)數(shù)期時(shí)取出細(xì)胞,PBS 洗兩遍,各加入150 μL RIPA 裂解液,冰上孵育20 min,用細(xì)胞刮刀刮下各組細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中,4℃、12000 r/ min 離心20 min,吸取上清液至0.5 mL EP 管中,冰上備用,采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度, 按需求加入蛋白上樣緩沖液( loading buffer)和雙蒸水以配制蛋白上樣樣品。 電泳:10%SDS-PAGE 凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離,每孔蛋白上樣量為30 μg。 轉(zhuǎn)膜:將凝膠上的分離蛋白通過轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。 室溫條件下,以5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h,按抗體要求加入Src(1 ∶1000)、p-Src(1 ∶1000)、LATS1(1 ∶5000)、p-LATS1(1 ∶1000)、YAP(1 ∶1000)、p- YAP(1 ∶1000)、GAPDH(1 ∶2000)4℃避光孵育過夜。 TBST 洗膜3 次,每次20 min,加入抗兔IgG-HRP 二抗(1 ∶3000),室溫避光孵育1 h,TBST 洗膜3 次,每次20 min。 通過ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,凝膠成像儀進(jìn)行成像并讀取灰度值,以GAPDH 灰度值進(jìn)行歸一化處理并計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 和Graphpad 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,所有數(shù)據(jù)以正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)均為正態(tài)分布,組內(nèi)兩樣本數(shù)據(jù)采用t 檢驗(yàn),多樣本采用單因素方差分析,后以LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行事后檢驗(yàn)。 P<0.05 為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-424-5P 表達(dá)水平

各組細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期后, RTFQ-PCR 檢測miR-424-5P 水平,結(jié)果顯示,Blank 組、NC 組及miR-424-5P-OV 組細(xì)胞相對(duì)miR-424-5P RNA 水平分別為(8.60±0.71)、(9.30±0.72)和(53.22±4.33),組間總體比較存在顯著性差異(P<0.01,F = 301.10),事后兩兩比較發(fā)現(xiàn),相較于NC 組,miR-424-5P-OV組miR-424-5P RNA 水平明顯上調(diào)(P<0.01,圖1)。

2.2 各組細(xì)胞活力比較

MTT 結(jié)果顯示,Blank 組和NC 組細(xì)胞活力曲線相類似,而miR-424-5P-OV 組細(xì)胞活力曲線較為平緩。 在72 h 時(shí),Blank 組、NC 組及miR-424-5P-OV組細(xì)胞活力分別為(306.55±8.20)、(310.89±8.20)和(188.26±3.10),組間總體比較存在顯著性差異(P<0.01,F = 288.78),事后兩兩比較發(fā)現(xiàn),與NC組相比,miR-424-5P-OV 組細(xì)胞活力明顯減弱( P<0.01,圖2)。

2.3 各組細(xì)胞克隆形成能力比較

采用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成能力,結(jié)果顯示,Blank 組、NC 組及miR-424-5P-OV 組細(xì)胞克隆形成率分別為100%、(106.25 ± 8.20) 和(43.26±3.10),組間總體比較存在顯著性差異(P<0.01,F = 140.70),事后兩兩比較發(fā)現(xiàn),相較于NC組,miR-424-5P-OV 組克隆形成能力明顯減弱( P<0.01,圖3)。

2.4 各組細(xì)胞YAP 核質(zhì)分布情況

免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞YAP 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分布情況,結(jié)果顯示,Blank 組和NC 組細(xì)胞YAP 以核表達(dá)為主,細(xì)胞質(zhì)分布較少。 miR-424-5POV 組細(xì)胞YAP 可見明顯的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核分布,見圖4。

2.5 各組細(xì)胞Src、YAP、 LATS1 及磷酸化表達(dá)差異

Western blot 法檢測各組細(xì)胞Src、p-Src、YAP、p-YAP、LATS1、p- LATS1 蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,各組細(xì)胞Src、YAP、LATS1 蛋白表達(dá)無明顯變化,Blank組、NC 組及miR-424-5P-OV 組p-Src 蛋白表達(dá)水平分別為100%、(98.60±8.30)%和(23.25±2.03)%,組間總體比較存在顯著性差異(P< 0.01,F=238.40),事后兩兩比較發(fā)現(xiàn),相較于NC 組,miR-424-5P-OV 組p-Src 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01);p-YAP 蛋白表達(dá)水平分別為( 56.36 ± 5.00)%、(58.92±4.63)%和(179.55±12.50)%,組間總體比較存在顯著性差異(P<0.01,F= 220.30),事后兩兩比較發(fā)現(xiàn),相較于NC 組,miR-424-5P-OV 組p-YAP蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);p-LATS1 蛋白表達(dá)水平分 別為( 12.30 ± 1.15)%、( 13.58 ± 1.20)% 和(123.75±9.26)%,組間總體比較存在顯著性差異(P<0.01,F= 420.40),事后兩兩比較發(fā)現(xiàn),相較于NC 組,miR-424-5P-OV 組p- LATS1 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01,圖5)

圖1 各組細(xì)胞miR-424-5P 表達(dá)水平Note.Compared with NC group, ??P<0.01.Figure 1 miR-424-5P expression levels in each group

圖2 各組細(xì)胞活力比較Note.Compared with NC group, ??P<0.01.Figure 2 Comparison of cell viability in each group

3 討論

miR-424-5P 作為miRNA 家族的一員,已證明在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌及肺癌等惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[9-10]。 但miR-424-5P 在結(jié)腸癌中的生物學(xué)功能還不清楚。 本研究通過過表達(dá)結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞miR-424-5P 表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力和克隆形成能力均明顯降低。 克隆形成能力可反應(yīng)細(xì)胞群體依賴性和增殖能力變化。 因此提示,miR-424-5P 可抑制HT-29 細(xì)胞增殖。 為了觀察miR-424-5P 抑制HT-29 細(xì)胞增殖的信號(hào)機(jī)制,本研究在分子水平上進(jìn)行了研究。 免疫熒光結(jié)果顯示,miR-424-5P 過表達(dá)可增加YAP 的細(xì)胞質(zhì)分布。 觀察YAP 相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),YAP 及其上游信號(hào)蛋白LATS1 的磷酸化水平均顯著升高。 一般來說,YAP 磷酸化時(shí)定位于細(xì)胞質(zhì),而去磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核直接參與靶基因的轉(zhuǎn)錄, 從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[11-13],提示本研究miR-424-5P 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)可能與LATS1-YAP 磷酸化激活有關(guān)。

圖3 各組細(xì)胞克隆形成能力Note.Compared with NC group, ??P<0.01.Figure 3 Cell cloning ability of each group

圖4 各組細(xì)胞YAP 核質(zhì)分布情況Figure 4 Distribution of YAP nucleus in each group

圖5 各組細(xì)胞Src、YAP、LATS1 及磷酸化表達(dá)差異Note.Compared with NC group, ??P<0.01.Figure 5 Different expressions of Src, YAP, LATS1 and their phosphorylation in each group of cells

Src 作為一種癌基因,已發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為。 同時(shí),研究還發(fā)現(xiàn),Src 在惡性腫瘤細(xì)胞增殖中也發(fā)揮關(guān)鍵介導(dǎo)作用[14-15]。 最近的研究報(bào)道,Src 參與調(diào)節(jié)YAP 的磷酸化水平,抑制Src 可促進(jìn)YAP 的磷酸化[16-17]。 基于上述報(bào)道,本研究對(duì)Src 進(jìn)行了觀察。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-424-5P過表達(dá)后TH - 29 細(xì)胞Src 磷酸化水平顯著降低。提示, miR-424-5P 可能通過抑制Src, 從而誘導(dǎo)LATS1 磷酸化,進(jìn)而磷酸化YAP。 但miR-424-5P 對(duì)Src 的調(diào)控機(jī)制還不清楚,有待于進(jìn)一步研究。

當(dāng)前,雖然miRNA 仍然是研究熱點(diǎn),但仍有一部分miRNA 的生物學(xué)功能待于研究。 本研究發(fā)現(xiàn)miR-424-5P 過表達(dá)可抑制結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞增殖,而該作用可能抑制Src 磷酸化,進(jìn)而磷酸化YAP 并使后者入核減少有關(guān)。 這為揭示miR-424-5P 在結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)理論支持。但腫瘤具有異質(zhì)性,miRNA 在不同腫瘤細(xì)胞中的功能也不完全一致,這給miRNA 的研究增加了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。 因此,對(duì)于miRNA 與腫瘤的關(guān)系還需要更多研究進(jìn)行探討。