范軍朝宋俊杰陳 勇

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,河南 開(kāi)封 475001)

酸棗仁是鼠李科棗屬植物酸棗的干燥成熟種子[1]。 根據(jù)古方記載,酸棗仁具有 “治煩心不得眠,虛汗,補(bǔ)中益氣之功效”[2]。 目前人們從酸棗仁中分離得到的化合物已經(jīng)有超過(guò)130 多種,包括皂苷、生物堿、脂肪酸等。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),酸棗仁皂苷具有鎮(zhèn)靜安神的功效,并且在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及心腦血管方面也有很好的藥理活性[3]。

Wang 等[4]研究證明JuA 作為酸棗仁中含量最高的一種皂苷類(lèi)成分,它能夠增加海馬神經(jīng)元中的GABA 受體亞型中mRNA 的表達(dá),下調(diào)腸黏膜系統(tǒng)中相關(guān)血清素細(xì)胞因子水平,改善睡眠。 Jiang 等[5]通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法比較了酸棗仁中總皂苷、總黃酮及總多糖的鎮(zhèn)靜安神作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸棗仁中總皂苷能夠顯著延長(zhǎng)PS 模型小鼠的睡眠時(shí)間。 趙啟鐸等[6]研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁中總皂苷能夠明顯增強(qiáng)小鼠的抗抑郁作用,減少小鼠絕望不動(dòng)時(shí)間。 榮春蕾等[7]研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁提取物能夠明顯增強(qiáng)小鼠的抗焦慮作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)提高小鼠腦內(nèi)GABA含量,進(jìn)而增強(qiáng)GABAAR1 的表達(dá)。 Zhang 等[8]證明酸棗仁總皂苷提取物中主要活性成分是JuA 和JuB,并且它能夠在一定程度上改善由于酒精引起的有記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)能力。

阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD) 是一種非常常見(jiàn)的老年性神經(jīng)性病變疾病,也是造成人類(lèi)癡呆的最主要原因,目前來(lái)說(shuō)還沒(méi)有有效的治療措施[9]。 根據(jù)調(diào)查顯示,65 歲以上的老年人中AD的發(fā)病率約為12%左右,而85 歲以上的老年人中AD 的發(fā)病率竟然高達(dá)50%,目前來(lái)說(shuō),AD 已經(jīng)成為老年醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中最為重要的課題之一。 如此同時(shí),隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展,麻醉理念及麻醉技術(shù)也在不斷更新,老年人在全麻情況下進(jìn)行臨床手術(shù)更是越發(fā)廣泛,如何減輕手術(shù)過(guò)程中全麻手術(shù)對(duì)老年人AD 等神經(jīng)性病變的影響是目前來(lái)說(shuō)研究的熱點(diǎn)課題之一[10]。

目前來(lái)說(shuō),AD 病的發(fā)病原因還不是很清楚,可能與患者的遺傳及生活環(huán)境有很大的關(guān)系,近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)全麻藥物也是造成AD 發(fā)病的一個(gè)因素,但是對(duì)于其作用機(jī)理研究的非常少[11]。 本研究中,我們發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷能夠緩解七氟烷麻醉對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠的影響,并且是通過(guò)活化線粒體相關(guān)的凋亡信號(hào)通路,減少Aβ 聚集,降低Tau 蛋白磷酸化,抑制小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。 本研究的進(jìn)行為將來(lái)開(kāi)發(fā)更安全更有效的聯(lián)合麻醉劑提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只,雄性3xTg-AD 小鼠和其背景C57BL/ 6J雄性小鼠,清潔級(jí),2 ～3 月齡,28 ～35 g,購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心[SCXK(京) 2018-0001],飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)范。 于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院老鼠房[ SYXK ( 京) 2018 -0002]飼養(yǎng)半年左右,9 月齡時(shí),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。本研究得到了北京檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SHCIQAFTC-M015),同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,我們遵照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R 原則,對(duì)大鼠給予了恰當(dāng)?shù)娜说狸P(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

分子實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)MPbio;分子實(shí)驗(yàn)相關(guān)酶購(gòu)買(mǎi)于日本TaKaRa; 有機(jī)試劑購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)國(guó)藥;相關(guān)抗體購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Abcam;其它試劑及耗材均購(gòu)買(mǎi)于北京鼎國(guó)。

低溫高速離心機(jī)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Thermo Scientific;振蕩器購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)SCILOGEX;電熱恒溫干燥箱購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)精宏; 超聲振蕩器購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Fisher Scientific; Morris Water Maze 實(shí)驗(yàn)裝置購(gòu)買(mǎi)于Ethovision XT; 加熱磁力攪拌器購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)IKA RCT basic;動(dòng)物麻醉機(jī)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Harvard;手術(shù)器械等購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Fine Science Tools。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理方法

9 月齡雄性3xTg-AD 小鼠和其背景C57BL/ 6J小鼠,按照隨機(jī)分配原則,分為四組,每組12 只,分別為:野生對(duì)照組(生理鹽水)、三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組(生理鹽水)、三轉(zhuǎn)模型麻醉組(生理鹽水+七氟烷)、三轉(zhuǎn)模型給藥組( 生理鹽水+七氟烷+ZSS)。 所有小鼠,經(jīng)側(cè)腦室分別注射等容生理鹽水或0.1 μg / 4 μL 的酸棗仁皂苷,連續(xù)10 d,每天一次。 對(duì)照組小鼠吸入2 h 氧,麻醉組和給藥組吸入2 h 1.4% 七氟烷。

1.3.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)

(1)水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)量實(shí)驗(yàn)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。 水迷宮實(shí)驗(yàn)中所用裝置購(gòu)買(mǎi)于Ethovision XT,整個(gè)裝置是一個(gè)圓形水池,直徑為100 cm,水池深50 cm,水深30 cm,水池壁東、南、西、北四個(gè)方位有4 個(gè)等距離點(diǎn)的象限,在西南象限處有一直徑為10 cm 的平臺(tái),平臺(tái)位于水平面下1 cm 處。 本裝置中池壁是黑色,為了更好的識(shí)別黑色小鼠,我們?cè)诔刂屑尤肱Ｄ?水池中水溫保持在(25±1)℃,并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,要保持房間內(nèi)光照及物品擺放等室內(nèi)環(huán)境一致性。

(2)不可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。 小鼠在吸入七氟烷或氧氣后的24 h,開(kāi)始進(jìn)行不可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 d,每天在同一時(shí)間段訓(xùn)練4 次。 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí),將小鼠從東南西北任一方向向池壁放入水中,記錄池壁中小鼠入水點(diǎn),池周?chē)O(shè)置一個(gè)固定的參照物,確保小鼠能夠定位平臺(tái)。 水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)有追蹤小鼠游泳軌跡的自動(dòng)監(jiān)視裝置,能夠準(zhǔn)確的記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間, 也稱(chēng)為逃避潛伏期(escape latency)。

(3)Probe 實(shí)驗(yàn)。 水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第6 天,將水下平臺(tái)撤除,以東北角象限的池壁為小鼠入水點(diǎn),記錄小鼠在原平臺(tái)現(xiàn)象所停留的時(shí)間及穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

(4)可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。 水迷宮第7 天進(jìn)行可視平臺(tái)測(cè)定,即將平臺(tái)超出水面1 cm,并且用一紅旗做為標(biāo)記,以東北角現(xiàn)象的池壁為小鼠入水點(diǎn),將小鼠面對(duì)池壁放入水中,記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間。

1.3.3 Western blot 檢測(cè)

從-80℃冰箱中取出海馬組織,稱(chēng)取0.2 g,放入1.5 mL EP 管中,加入500 μL RIPA 裂解液,超聲勻漿3 次,每次10 s,于冰上靜止30 min,4℃,8000 r/ min 離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP 管中,用于后續(xù)檢測(cè)。

Western blot 試劑盒購(gòu)買(mǎi)于上海碧云天生物技術(shù),具體方法參見(jiàn)其說(shuō)明書(shū)。

1..3.4 Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)情況

從-80℃冰箱中取出海馬組織,液氮中磨碎成粉末,稱(chēng)取0.1 g 粉末于1.5 mL EP 管中,加1 mL TRIzol 溶液, 萃取RNA, 具體步驟參見(jiàn)TaKaRa TRIzol RNA 提取試劑盒。

RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,具體步驟參見(jiàn)TaKaRa cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

針對(duì)小鼠中線粒體凋亡信號(hào)通路基因BcL-2、Bax、Caspase-3 cDNA 全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物,具體引物序列參見(jiàn)表1。 熒光定量PCR 方法按照TaKaRa Real-time PCR 試劑盒的具體步驟與方法,通過(guò)定量分析這些基因的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 Real-time PCR 相關(guān)引物序列Table 1 Real-time PCR related primer sequences

2 結(jié)果

2.1 酸棗仁皂苷緩解七氟烷麻醉阿爾茨海默病模型小鼠的學(xué)習(xí)能力研究

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)主要是用來(lái)測(cè)定嚙齒類(lèi)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的一種重要方法,對(duì)動(dòng)物腦部海馬組織中與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的結(jié)構(gòu)功能損害非常敏感,經(jīng)常用來(lái)作為評(píng)價(jià)動(dòng)物藥效。

本研究中,Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 和表3所示,四組小鼠的逃避潛伏期,尋找平臺(tái)的滯留時(shí)間和穿梭平臺(tái)進(jìn)行比較,三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯比對(duì)照組差,而三轉(zhuǎn)模型麻醉組與三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組相比,差異不顯著(P>0.05),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 這個(gè)結(jié)果說(shuō)明,七氟烷麻醉對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有損傷。 但是三轉(zhuǎn)模型給藥組與三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組相比,小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到了提高,這個(gè)結(jié)果說(shuō)明,酸棗仁能夠改善阿爾茨海默病模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.2 小鼠海馬組織中Aβ 聚集情況

Aβ 是AD 發(fā)病機(jī)理中的核心成分,主要有Aβ1-40 和Aβ1-42 兩種多肽形式,其中Aβ1-42 肽鏈長(zhǎng),疏水性好,也是AD 中的核心蛋白。 Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示,與對(duì)照組相比,三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組小鼠中總Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42 含量顯著增加,與三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組相比,三轉(zhuǎn)模型麻醉組含量差異不明顯,表明七氟烷麻醉不影響海馬組織中總Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42 的含量,與三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組相比,三轉(zhuǎn)模型給藥組小鼠中總Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42 含量顯著下降,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 四組小鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期比較(± s ,n= 6)Table 2 Comparison of Morris water maze escape latency of four groups of mice

表2 四組小鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期比較(± s ,n= 6)Table 2 Comparison of Morris water maze escape latency of four groups of mice

注:與三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組相比,# P < 0.05,## P < 0. 01;與對(duì)照組相比,?P<0.05,??P<0.05。 下表同。Note.Compared with the three-transfer model control group, #P<0.05,##P<0.01.Compared with the control group, ?P < 0. 05,??P < 0.05.The same as below.

對(duì)照組Con 57.2±4.4 54.9±3.7 50.5±3.2 47.5±2.9 45.6±3.0模型對(duì)照組Model Con 60.8±3.8? 58.3±4.8? 54.8±3.7??50.5±3.3?47.1±3.7?實(shí)驗(yàn)組1 Group 1 61.0±3.5 58.8±3.4? 55.0±3.1? 50.7±2.6?47.3±3.2實(shí)驗(yàn)組2 Group 2 58.1±4.2# 55.3±4.0## 51.0±2.5# 48.2±3.1# 45.7±2.9#

表3 四組小鼠Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(± s ,n= 6)Table 3 Comparison of the results of Morris water maze space exploration experiment in four groups of mice

表3 四組小鼠Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(± s ,n= 6)Table 3 Comparison of the results of Morris water maze space exploration experiment in four groups of mice

組別Groups探索時(shí)間(s)Explore time穿越平臺(tái)次數(shù)(次)Number of crossing platforms (times)對(duì)照組Con 41.8±2.2 4.5±1.7模型對(duì)照組Model Con 43.4±2.6? 3.2±0.9??實(shí)驗(yàn)組1 Group 1 43.5±3.4? 3.3±1.3?實(shí)驗(yàn)組2 Group 2 42.0±2.8# 4.0±1.5##

圖1 小鼠海馬組織中Aβ 聚集情況Figure 1 Aβ aggregation in mouse hippocampus

2.3 小鼠海馬組織中Tau 蛋白磷酸化情況

Tau 蛋白是細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的微管蛋白,當(dāng)Tau 蛋白異常聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的時(shí)候會(huì)引起微管解體、斷裂,研究發(fā)現(xiàn)Tau 蛋白與AD 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。 Tau 蛋白磷酸化位點(diǎn)包括絲氨酸396 和262,蘇氨酸231,這些磷酸化位點(diǎn)在AD 發(fā)病中有著非常重要的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2,與對(duì)照組相比,三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組小鼠中Tau 蛋白磷酸化含量顯著增加,與三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組相比,三轉(zhuǎn)模型麻醉組含量差異不明顯,表明七氟烷麻醉不影響海馬組織中Tau 蛋白磷酸化的含量,與三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組相比,三轉(zhuǎn)模型給藥組小鼠中Tau 蛋白磷酸化含量顯著下降,差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 Real-time PCR 檢測(cè)小鼠海馬線粒體相關(guān)凋亡信號(hào)通路基因表達(dá)

線粒體是細(xì)胞能量的主要來(lái)源,其活性決定了細(xì)胞的生死存亡。 AD 發(fā)病早期一個(gè)重要的特征就是線粒體功能障礙。 當(dāng)AD 發(fā)生時(shí)Aβ 和Tau 蛋白聚集會(huì)直接損傷線粒體,引起線粒體破裂,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C 的釋放,細(xì)胞凋亡因子Caspase-3的釋放。 Bax 是促凋亡基因,BcL-2 是非常重要的抗凋亡基因,能夠抑制Bax 的活性。 本研究通過(guò)Realtime PCR 對(duì)線粒體通路相關(guān)凋亡基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3 所示,與對(duì)照組相比,三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組中BcL-2 表達(dá)減少,Bax 和Caspase-3 表達(dá)增強(qiáng);與三轉(zhuǎn)模型對(duì)照組相比,三轉(zhuǎn)麻醉組中BcL-2 表達(dá)減少,Bax 和Caspase-3 表達(dá)增強(qiáng),這個(gè)結(jié)果說(shuō)明,七氟烷麻醉會(huì)影響小鼠海馬線粒體活性;與三轉(zhuǎn)模型麻醉組相比, 三轉(zhuǎn)給藥組中, BcL-2 表達(dá)增強(qiáng), Bax 和Caspase-3 表達(dá)減少,這個(gè)結(jié)果說(shuō)明,酸棗仁苷會(huì)緩解七氟烷麻醉影響小鼠海馬線粒體活性。

3 討論

酸棗是我國(guó)特有的藥用植物,蘊(yùn)藏量巨大,酸棗仁是其種子,在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的研究已有幾千年的歷史。 目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)酸棗仁皂苷進(jìn)行分離鑒定,發(fā)現(xiàn)其成分多達(dá)50 多種。 酸棗仁皂苷在鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁、抗焦慮以及改善記憶等方面都 有顯著的活性[12]。

圖2 小鼠海馬組織中Tau 蛋白磷酸化情況Figure 2 Phosphorylation of Tau protein in mouse hippocampus

圖3 小鼠海馬線粒體相關(guān)凋亡信號(hào)通路基因表達(dá)Figure 3 Mouse hippocampal mitochondrial related apoptosis signaling pathway gene expression

AD 是致使人類(lèi)癡呆的主要原因,目前來(lái)說(shuō),沒(méi)有有效的治療措施。 對(duì)于其發(fā)病原因及形成機(jī)制,仍然不是很清楚。 研究表明,全麻藥物能夠增加AD 發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn),加重AD 神經(jīng)病理的改變。 研究發(fā)現(xiàn),病人手術(shù)過(guò)程中進(jìn)行全麻能夠加重病人認(rèn)知功能障礙[13]。 研究表明,全麻藥物加重AD 患者的癥狀和神經(jīng)病理過(guò)程[14]。

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)智齒類(lèi)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的一個(gè)重要手段,經(jīng)常用來(lái)作為藥物作用效果的評(píng)價(jià)方法[15]。 根據(jù)研究,異氟醚最低肺泡濃度為1.1% ～1.2%, 臨床手術(shù)時(shí)常用濃度為1.0% ～2.0%,本研究根據(jù)這個(gè)選擇了本研究中異氟醚麻醉的濃度1.4%。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1.4%七氟烷2 h 對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力影響不明顯,臨床上患者進(jìn)行手術(shù)時(shí)所用麻醉量是1% ～2%之間,這個(gè)結(jié)果說(shuō)明,手術(shù)時(shí),全麻在一定程度上是安全的,對(duì)機(jī)體副作用小。

AD 病的發(fā)病機(jī)理復(fù)雜,但是隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,越來(lái)越多與AD 病相關(guān)的一些蛋白,調(diào)控因子作用被發(fā)現(xiàn)[16]。 Aβ 是AD 發(fā)病機(jī)理中的核心成分,主要有Aβ1-40 和Aβ1-42 兩種多肽形式,其中Aβ1-42 肽鏈長(zhǎng),疏水性好,是AD 中的核心蛋白。 本研究發(fā)現(xiàn)1.4%七氟烷2 h 對(duì)Aβ 聚集含量影響不大,但酸棗仁皂苷能降低AD 病中Aβ 聚集的含量。

Tau 蛋白是細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的微管蛋白,當(dāng)Tau 蛋白異常聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的時(shí)候會(huì)引起微管解體、斷裂,研究發(fā)現(xiàn)Tau 蛋白與AD 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。 Tau 蛋白磷酸化位點(diǎn)包括絲氨酸396 和262,蘇氨酸231,這些磷酸化位點(diǎn)在AD發(fā)病中有著非常重要的作用。 本研究發(fā)現(xiàn)1.4%七氟烷2 h 對(duì)Tau 蛋白磷酸化影響不大,但是酸棗仁皂苷能降低AD 病中Tau 蛋白磷酸化的影響。

AD 病神經(jīng)元發(fā)生病變的過(guò)程中,一個(gè)主要的病理特征就是細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 研究表明,體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),七氟烷處理體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因子Caspase-3 的釋放[17-18]。 本研究發(fā)現(xiàn)1.4%七氟烷2 h 確實(shí)引起抗凋亡基因BcL-2 的下調(diào)表達(dá),促凋亡基因Bax 和細(xì)胞凋亡基因Caspase 上調(diào)表達(dá),當(dāng)用一定濃度的酸棗仁皂苷處理后,抗凋亡基因BcL-2 上調(diào)表達(dá),促凋亡基因Bax 和細(xì)胞凋亡基因Caspase 發(fā)生下調(diào)表達(dá)。