于庭洪 賈 姝 宋 策 赫英姿 趙 翀 左玲玲

(遼寧省蠶業(yè)科學研究所，遼寧鳳城 118100)

柞蠶(Antheraeapernyi)為鱗翅目(Lepidoptera)、大蠶蛾科(Saturniidae)、柞蠶屬(Antheraea)的一種大型泌絲、食用及工業(yè)原料昆蟲[1-2]，是我國重要的經濟昆蟲資源之一。柞蠶核型多角體病毒病又稱柞蠶膿病，是由柞蠶核型多角體病毒(Antheraeapernyinucleopolyhedrovirus，ApNPV)感染引起的柞蠶主要病害之一，其侵染蔓延劇烈，發(fā)生廣泛，對柞蠶危害嚴重。世界上飼養(yǎng)柞蠶的國家都有發(fā)生，我國遼寧、吉林、黑龍江、內蒙古、山東、河南等各蠶區(qū)普遍發(fā)生，遼寧省一般發(fā)病年份發(fā)病在10%～20%，嚴重時達50%以上[3]。目前，有學者已對ApNPV生物學特性[4]、毒力[5]、感染規(guī)律[6]等進行了較為深入的研究，對ApNPV的分子生物學研究也進展迅速，已完成該病毒的全基因組測序及部分重要基因的功能研究[7-12]，這些研究成果對于建立病害防治的新策略具有重要意義。通過研究核型多角體病毒侵染對柞蠶4齡幼蟲保護酶活性的影響[13]，檢測過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性在接種后的變化趨勢，確定其對柞蠶生長發(fā)育和血淋巴營養(yǎng)物質的影響，有助于從生理生化角度揭示核型多角體病毒對柞蠶的致病機理，還可以為進一步弄清柞蠶與病原微生物之間的拮抗關系提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試柞蠶品種為抗大。將孵化后的柞蠶幼蟲在室內溫度24 ℃、相對濕度75%環(huán)境下以麻櫟葉飼養(yǎng)至4齡第3天，用于病毒添食處理。

供試核型多角體病毒：由本所柞蠶病害防治課題組保存。

1.2 ApNPV純化和幼蟲感染

取保存的感病柞蠶幼蟲，使用體積分數為75%乙醇進行體表消毒后加滅菌水充分研磨。將研磨液轉移至離心管中，500 r/min離心1 min，取上清液；4℃條件下3000 r/min離心5 min，棄上清，用無菌水懸浮沉淀，以上操作重復3次，離心后棄上清，沉淀加適量無菌水配制成濃度為2×109PIB/mL的多角體懸浮液備用。

取柞蠶4齡第3天幼蟲70頭，將ApNPV多角體按照1×107個/頭(約5 μL病毒多角體懸液)的劑量，用微量進樣器經口直接接種供試幼蟲，幼蟲接種病毒后繼續(xù)在室內(24 ℃ )飼養(yǎng)。

1.3 ApNPV侵染對幼蟲生長的影響

取處理組和對照組柞蠶各30頭(共3組，10頭/組)。每隔24 h調查柞蠶的體重、給葉量、殘葉量，記錄數據并用SPSS19.0數據統(tǒng)計分析軟件進行分析。

攝食量(g)=飼養(yǎng)期間給葉量(g)-殘留葉量(g)

1.4 ApNPV侵染對幼蟲血淋巴營養(yǎng)物質含量的影響

處理后每隔 24 h，取病毒接種處理組及正常對照組幼蟲各5頭，剪破第3腹足混合取血淋巴作為待測樣品，置于液氮中迅速冷凍后移入20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 被侵染幼蟲血淋巴總糖含量的測定

參照肖猛[14]的方法制備無蛋白溶液。然后用蒽酮比色法[15]測定柞蠶幼蟲血淋巴總糖含量，每個處理重復3次。血淋巴中總糖的含量，以mg·mL-1表示。

1.4.2 被侵染幼蟲血淋巴海藻糖含量的測定

參照文獻[16]的方法，以海藻糖標準品制作標準曲線。取1 mL稀釋后的待測樣品加入0.15 mol/L濃硫酸0.2 mL，搖勻后沸水浴加熱5 min，冷卻后再加入30% KOH溶液0.2 mL，搖勻后沸水浴加熱5 min，再冷卻后加入4 mL蒽酮試劑，搖勻后沸水浴加熱5 min，待冷卻后用紫外分光光度計在620 nm處測定OD值。每個處理重復3次。血淋巴中海藻糖的含量，以mg·mL-1表示。

1.4.3 被侵染幼蟲血淋巴蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[17]。每個處理重復3次。血淋巴中蛋白質的含量，以mg·mL-1表示。

1.4.4 被侵染幼蟲血淋巴酯酶活性的測定

參照陳長琨的方法[18]，稍有改動。在5 mL含3×10-4mol/L的α-醋酸萘脂的磷酸緩沖液(pH=7.0)中加入稀釋一定倍數的血淋巴1 mL搖勻，置25 ℃溫浴中30 min，立即加入1 mL顯色液，室溫下30 min待出現穩(wěn)定的藍綠色，測得OD600值，重復3次。根據標準曲線計算出血淋巴酯酶的活力大小。

2 結果與分析

2.1 感染ApNPV后柞蠶幼蟲生長發(fā)育的變化

采用Microsoft Excel和SPSS19.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，對同一時間不同處理的差異進行單因素方差分析和Duncan氏多重比較。經ApNPV處理后幼蟲的攝食量變化如表1所示，添毒后1～3 d，處理組與對照組的柞蠶幼蟲攝食量均有所提高，不同處理間差異不明顯(P>0.05)；隨后對照組幼蟲攝食量有所下降，而處理組幼蟲攝食量從第4天起開始下降，第6天與對照組達到顯著水平(P<0.05)，第7、第8天達到極顯著水平(P<0.01)。經ApNPV處理后幼蟲的體重變化如表2所示，對照組幼蟲體重呈現持續(xù)上升趨勢；處理組添毒后1～6 d，幼蟲體重逐漸升高，但始終低于對照，與對照組差異不顯著(P>0.05)；第7天，幼蟲體重開始呈負增長，與對照組差異顯著(P<0.05)；到第8天，處理組幼蟲體重極顯著低于對照組(P<0.01)。

表1 ApNPV侵染對柞蠶幼蟲攝食量的影響

表2 ApNPV侵染對柞蠶幼蟲體重的影響

2.2 感染ApNPV后柞蠶幼蟲血淋巴總糖含量的變化

ApNPV侵染后柞蠶血淋巴總糖含量變化如圖1所示。處理組和對照組的血淋巴總糖含量均先升高后降低。處理后1 d，添毒幼蟲血淋巴總糖含量極顯著低于對照組(P<0.01)，第2天，處理組總糖含量顯著升高達到峰值(9 mg/mL)，略高于對照組但并未達到顯著水平(P>0.05)；隨后，對照組繼續(xù)升高，在第3天達到最大值(8.711 mg/mL)后開始下降，處理組總糖含量開始逐漸下降，并極顯著低于對照組(P<0.01)。

2.3 感染ApNPV后柞蠶幼蟲血淋巴海藻糖含量的變化

ApNPV侵染后柞蠶血淋巴海藻糖含量變化如圖2所示。添毒后第1天，處理組與對照組海藻糖含量相差不大，未達到顯著水平(P>0.05)；第2至第8天，兩組海藻糖含量均呈現“升高—降低—升高”的趨勢，但處理組海藻糖含量總體均極顯著低于對照組(P<0.01)。

2.4 感染ApNPV后柞蠶幼蟲血淋巴蛋白質含量的變化

ApNPV侵染后柞蠶血淋巴蛋白質含量變化如圖3所示。添毒處理后，柞蠶幼蟲血淋巴蛋白質含量逐漸升高到第7天達到峰值(68.32 mg/mL)，隨后略有下降；對照組第1至第5天，變化較平緩，第6天有所上升到第7天達到峰值(47.22 mg/mL)后下降。第1至第3天，兩組差異不顯著，3 d后處理組幼蟲蛋白質含量顯著升高，并明顯高于對照組(P<0.01)。

2.5 感染ApNPV后柞蠶幼蟲血淋巴酯酶活性的變化

ApNPV侵染后柞蠶血淋巴酯酶活性變化如圖4所示。處理組和對照組血淋巴酯酶活性均升高，分別在第7天達到最大值(處理組9.95×10-4mol/L、對照組7.54×10-4mol/L)，隨后略有下降；添毒后第1天，幼蟲的酯酶活性顯著低于對照組(P<0.05)，隨后處理組酯酶活性顯著升高，第2至第6天與對照組無明顯差異(P>0.05)；4 d后高于對照組，到第7、第8天，處理組酯酶活性極顯著高于對照組(P<0.01)。

3 討 論

核型多角體病毒侵染擾亂了柞蠶幼蟲正常的生長發(fā)育，表現為攝食量異常、生長發(fā)育緩慢甚至出現負增長。體重是反映動物營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標，其穩(wěn)定性依賴于能量攝入和能量消耗之間的平衡[19]。對照組柞蠶的體重持續(xù)升高，表明幼蟲能量攝入量高于消耗量，使其能量積累體重升高；而處理組在添毒初期，柞蠶幼蟲的攝食量增長并且高于健康柞蠶，柞蠶體重升高，但仍低于對照；添毒后5～8 d，添毒幼蟲的攝食量顯著較少，其體重也增長緩慢，始終低于對照，第7、第8天，添毒幼蟲體重開始呈負增長，與對照組差異顯著。說明ApNPV侵染刺激了柞蠶的消化系統(tǒng)，使其攝食量上升，體重增加，但隨著ApNPV在蠶體內的增殖，柞蠶體內正常的生長發(fā)育被擾亂，使其攝食量減少，能量攝入減少，體重下降。

ApNPV侵染對柞蠶血淋巴營養(yǎng)物質含量也有明顯影響。病毒侵染初期，柞蠶血淋巴總糖含量升高，在第2天達到峰值，略高于對照組，隨后開始下降并且顯著低于對照組；添毒幼蟲海藻糖含量顯著低于健康幼蟲；蛋白質含量顯著升高；酯酶活性升高。昆蟲血淋巴中含有昆蟲生理活動所必需的一切物質及代謝產物。糖類是昆蟲血淋巴的重要組分，是血淋巴貯存和運輸能源物質的的重要形式，其中海藻糖是柞蠶的血糖，蠶體主要以海藻糖形式向各組織輸送糖類以滿足各組織的代謝需要[1]。ApNPV侵染初期，柞蠶受到外源物刺激，需要更多能量抵御外源物入侵，糖類合成加速，使總糖含量小幅度升高，但隨著病毒核酸的復制、蛋白質的合成以及柞蠶防御系統(tǒng)的啟動都需要大量的能量，造成柞蠶血淋巴總糖和海藻糖含量顯著下降。處理組柞蠶血淋巴蛋白質含量的升高可能由于病毒的侵染刺激宿主防御系統(tǒng)發(fā)揮作用，血淋巴中產生更多的與免疫機制相關的酶類[20]，或者是由于柞蠶各組織器官功能受阻，對食物消化吸收功能減弱，血淋巴中的蛋白質分解轉運受到抑制，而滯留在血淋巴中。感病柞蠶酯酶活性升高說明其分解脂類的能力增強，而脂類貯藏于脂肪體，所以酯酶活性增強破壞了脂肪體結構，導致昆蟲組織解離，加速昆蟲死亡。

綜上所述，從柞蠶幼蟲生長發(fā)育和血淋巴營養(yǎng)物質等指標的變化可以看出，外源微生物的入侵與增殖必然會擾亂柞蠶正常的生理調節(jié)、發(fā)育和代謝功能等，從而導致蠶患病直至死亡。深入研究病原微生物對柞蠶各項生理生化指標的影響，有助于進一步闡明其致病機理，并為弄清寄主與病原物之間的關系提供重要信息。