沃東軍/內(nèi)蒙古呼倫貝爾鄂溫克旗職業(yè)中學(xué) 021100

高希真/山東元亨臨床獸醫(yī)學(xué)校 271100

李春建/山東濟(jì)南國際馬術(shù)交流中心 250000

谷巍 徐海燕 亓秀曄 趙晨/山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 271000

鑒于飼用抗生素對(duì)生物安全和免疫功能的威脅和破壞，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年7月9日發(fā)布第194號(hào)公告，果斷地將飼料養(yǎng)殖行業(yè)依賴幾十年之久的抗生素藥物添加劑推下歷史舞臺(tái)。這表明，“禁抗風(fēng)潮”不再只是一句口號(hào)，我國已經(jīng)全面進(jìn)入藥物限抗、飼料禁抗新時(shí)代。因此，尋求綠色環(huán)保型飼用抗生素替代產(chǎn)品是解決抗生素產(chǎn)生負(fù)面影響的有效途徑之一。益生菌是抗生素的最佳替代品之一，是能夠改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)并提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物。微生態(tài)制劑不僅可以產(chǎn)生促生長因子、多種消化酶和維生素，進(jìn)而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收及動(dòng)物的生長繁殖。此外。還可以產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子和干擾素等免疫活性物質(zhì)，刺激腸道局部免疫器官的生長發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高動(dòng)物機(jī)體的抵抗力，具有廣闊的發(fā)展前景。

品種馬作為競(jìng)技運(yùn)動(dòng)和技巧表演動(dòng)物是動(dòng)物中的運(yùn)動(dòng)員，對(duì)馬的要求較高。青年時(shí)期的馬駒處于速度暴發(fā)期，此階段是賽馬，表演馬的最佳候選。自古至今賽馬形式變化甚多，但基本原則都是競(jìng)賽速度和技巧表演，這也表明高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)下，賽馬和表演馬總有各種疾病的困擾，特別是胃腸道疾病。因此維持賽馬的胃腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，對(duì)延長賽期尤為重要。本文對(duì)青年品種馬進(jìn)行補(bǔ)喂免疫微生態(tài)制劑威克，研究其對(duì)品種馬的免疫機(jī)能，為品種馬的健康養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器試劑：免疫微生態(tài)制劑威克由山東寶來利來生物工程股份有限公司生產(chǎn)；馬血清免疫球蛋G（IgG）試劑盒（ELISA）和馬分泌型免疫球蛋白A（sIgA）試劑盒（ELISA）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。馬血清白介素-/2（IL-2）和γ-干擾素（IFN-γ）（ELISA）試劑盒購自北京華英生物技術(shù)公司。

器材：采血管、采血針、離心管、PBS等常規(guī)的試劑由試劑公司購買。

儀器：全自動(dòng)酶標(biāo)儀（ELx800）；低溫高速離心機(jī)（TGL20M）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082）；低速離心機(jī)（LDE-2A）；均由寶來利來研究院提供。

1.2 基礎(chǔ)日糧的配比馬的基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平參考NRC（2007）馬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)及地方現(xiàn)有飼料條件制定并制成顆粒飼料。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（%）

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì)于2020年4月在濟(jì)南國際馬術(shù)交流中心進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選擇青年馬、體重相近的品種馬10匹，隨機(jī)分成2個(gè)組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1匹馬。所有試驗(yàn)馬按照飼養(yǎng)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂基礎(chǔ)日糧，另外，試驗(yàn)組口服免疫微生態(tài)制劑威克，每天1次，每次1支，6h內(nèi)服用完，連用3天，試驗(yàn)期為30天。

于每日08:00、14:00、18:00定量飼喂，先精后粗、少量多次，自由飲水，每個(gè)試驗(yàn)組的重復(fù)組單圈舍飼養(yǎng)，試驗(yàn)馬駒驅(qū)蟲按馬場(chǎng)生產(chǎn)管理進(jìn)行。

1.4 血清細(xì)胞生長因子的測(cè)定分別于第一次使用免疫微生態(tài)后的第0d、7d、14d、30d的早8:00，每個(gè)試驗(yàn)組5匹試驗(yàn)馬，空腹頸靜脈采血3mL，4000r/min 離心10min，分離血清，-20℃凍存。馬血清中白介素-2（IL-2）和γ-干擾素（IFN-γ）均用ELISA試劑盒及全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.5 血清IgG含量的測(cè)定分別于第一次使用免疫微生態(tài)后的第0d、7d、14d、30d的早8:00，每個(gè)試驗(yàn)組5匹試驗(yàn)馬，空腹頸靜脈采血3mL，4000r/min 離心10min，分離血清，-20℃凍存。血清中Ig G含量測(cè)定采用馬血清免疫球蛋G（IgG）試劑盒（ELISA）及全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.6 糞便sIgA水平測(cè)定分別于第一次使用免疫微生態(tài)后的第0d、7d、14d、30d的早08:00采集完血后按各組標(biāo)準(zhǔn)飼喂，將試驗(yàn)馬牽入室內(nèi)圈舍，單欄位拴系并套帶收糞袋。將每匹試驗(yàn)馬自進(jìn)圈后至10:00排出的全部糞便收集于集糞桶內(nèi)，混合均勻后，采用5點(diǎn)取樣法采集試驗(yàn)馬糞樣，每個(gè)點(diǎn)采集5±0.5g，再將5個(gè)點(diǎn)共25±2.5g糞樣混合均勻后立即裝入密封袋，-20℃保存待測(cè)。

凍存糞樣于室溫解凍后，分別將各濕糞樣于研缽中充分研磨混勻。稱取1.0g研磨混勻的濕糞于15mL圓底離心管中，加入10mL PBS緩沖液（pH7.2），在漩渦振蕩器上振蕩混勻，4℃下12 000r/min離心20min，吸取上清液利用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組馬新鮮糞便中的sIgA含量。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 19.0軟件GLM程序進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 免疫微生態(tài)制劑對(duì)青年品種馬血清細(xì)胞生長因子的影響

表2 免疫微生態(tài)制劑對(duì)青年品種馬血清細(xì)胞生長因子的檢測(cè)結(jié)果 （pg/mL）

研究發(fā)現(xiàn)，免疫微生態(tài)制劑分泌的細(xì)胞活性因子IL-2和IFN-γ等能夠激發(fā)免疫應(yīng)答，促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著試驗(yàn)馬日齡的增加，試驗(yàn)組的細(xì)胞活性因子水平逐漸升高，而對(duì)照組一直在較低水平。第一次免疫后的30d，試驗(yàn)組的IL-2水平極顯著高于對(duì)照組30.47%（P＜0.01）；而第7d和第14d時(shí)，試驗(yàn)組的IFN-γ水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），第30d時(shí)極顯著高于對(duì)照組27.94%（P＜0.01）。這說明免疫微生態(tài)制劑威克的添加提高了賽馬的細(xì)胞活性因子，增強(qiáng)了機(jī)體的免疫性能。

2.2 免疫微生態(tài)制劑對(duì)青年品種馬血清中IgG含量的影響

表3 免疫微生態(tài)制劑對(duì)青年品種馬血清中IgG含量的檢測(cè)結(jié)果 （μg/mL）

血清中的免疫球蛋白主要有IgG、IgA、IgM，這些免疫球蛋白可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，在動(dòng)物機(jī)體免疫中起著重要作用。IgG 主要由脾臟中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，在抵抗感染中起著重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著試驗(yàn)馬日齡的增加，試驗(yàn)組的血清IgG水平逐漸升高，而對(duì)照組浮動(dòng)不大。其中，使用免疫微生態(tài)制劑威克后的第7d、14d和30d，試驗(yàn)組馬血清中的IgG含量均高于對(duì)照組，其中第14d和30d，試驗(yàn)組馬血清中的IgG含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），與對(duì)照組相比分別提高了27.67%和38.17%。這說明免疫微生態(tài)制劑威克可以提高馬血清中免疫球蛋白IgG的含量?？赡苡捎诿庖呶⑸鷳B(tài)制劑刺激機(jī)體漿細(xì)胞分泌抗體，提高了血清中Ig G的含量，增強(qiáng)機(jī)體抗感染的能力。

2.3 免疫微生態(tài)制劑對(duì)青年品種馬糞便中sIgA含量的影響

表4 免疫微生態(tài)制劑對(duì)青年品種馬糞便中sIgA含量的檢測(cè)結(jié)果 （μg/g）

分泌型IgA（sIgA）是參與黏膜免疫反應(yīng)的重要抗體，IgA 占據(jù)著黏膜表面，阻止病原體吸附，起到中和抗體的作用，阻止病原體和毒素進(jìn)入細(xì)胞，其抗感染保護(hù)作用已被大量研究所證實(shí)。sIgA的形成和作用主要局限于黏膜區(qū)，同時(shí)通過黏膜淋巴細(xì)胞的遷徙過程，又廣泛分布于身體各處黏膜。本試驗(yàn)結(jié)果表明：免疫后第7d、14d和30d，試驗(yàn)組的sIgA含量均高于對(duì)照組，其中第14d和30d，試驗(yàn)組馬血清中的sIgA含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），與對(duì)照組相比分別提高了26.67%和24.91%。而整個(gè)試驗(yàn)周期，對(duì)照組的sIgA含量一直處于較低水平，這說明，添加免疫微生態(tài)制劑威克可極顯著刺激馬的黏膜抗體sIgA產(chǎn)生，促進(jìn)局部黏膜反應(yīng)，從而引起全身黏膜反應(yīng)，起到抗感染的作用。

3 結(jié)論

3.1 在整個(gè)試驗(yàn)周期，空白對(duì)照組的細(xì)胞活性因子IL-2和IFN-γ水平、血清IgG含量和糞便sIgA的含量一直處于較低水平，無明顯變化。

3.2 免疫微生態(tài)制劑威克的添加極顯著提高了試驗(yàn)馬在免疫后的細(xì)胞活性因子IL-2和IFN-γ水平，免疫后第30d與對(duì)照組相比分別提高了30.47%和27.94%（P＜0.01）。

3.3 免疫微生態(tài)制劑威克的添加極顯著提高了試驗(yàn)馬在免疫后的血清IgG含量，免疫后第14d和30d與對(duì)照組相比分別提高了27.67%和38.17%（P＜0.01）。

3.4 免疫微生態(tài)制劑威克的添加極顯著提高了試驗(yàn)馬在免疫后的糞便sIgA的含量，免疫后第14d和30d與對(duì)照組相比分別提高了26.67%和24.91%（P＜0.01），促進(jìn)機(jī)體黏膜免疫反應(yīng)。