劉發(fā)全 袁琪/安徽省獸藥飼料監(jiān)察所 230091

本實驗參考相關文獻報道，研究了高效液相色譜法測定飼料中喹烯酮，方法準確、簡便，靈敏度高，可滿足檢測需求。

1 儀器與試劑

1.1 儀器Agilent 1260高效液相色譜儀，配紫外檢測器、自動進樣器和柱溫箱；Waters Symmetry C18(4.6×250mm 5μm)色譜柱；UV-2501PC紫外分光光度計；BS21S天平：感量0.01mg，Bs224s天平：感量0.1mg；BP100s酸度計：pH（1-14）；CR22G離心機；KQ-300DE超聲波清洗機。

1.2 試劑喹烯酮對照品（批號：H200806，含量99.4%），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；飼料，來自安徽某飼料生產(chǎn)企業(yè)；乙腈、甲醇均為色譜純，F(xiàn)ISHER Chemical公司，二甲基甲酰胺、磷酸均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司，水：水質(zhì)符合實驗室一級用水的規(guī)定。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 流動相的配制流動相：乙腈-甲醇-水(25:20:55)體積比配制，用磷酸(0.25mol/L)調(diào)pH=3.0混勻；

2.1.2 喹烯酮標準儲備液精密稱取喹烯酮對照品50mg于100ml棕色容量瓶，用10ml二甲基甲酰胺溶解，加入甲醇至刻度，溶解成500μg/mL的儲備液。

2.1.3 工作液的配置臨用前精密量取喹烯酮儲備液，用流動相稀釋成濃度為2、5、10、20、40、100μg/mL的標準工作液。

2.1.4 供試品溶液的制備取飼料樣品約500g，四分法縮減至100，磨碎，全部通過0.42mm孔徑分析篩，充分混勻，精確稱取飼料飼料2g置于50mL離心管中，準確加入流動相25mL，振搖混勻，超聲提取30min后，以8000r/min離心10min，取離心上清液用0.45μm尼龍濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 高效液相色譜條件色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6×250mm 5μm)色譜柱，流動相：乙腈-甲醇-水(25:20:55)體積比（V:V）pH=3.0,流速為1.0mL/min，檢測波長260nm,柱溫：室溫，進樣量：10μL，在上述色譜條件下，喹烯酮對照品溶液的典型色譜圖見圖1。

Fig.1chromatogram map of Quinocetone

2.3 線性關系考察依次吸取喹烯酮標準工作液2、5、10、20、40、100μg/mL繪制標準工作曲線及回歸方程，以喹烯酮溶液濃度（μg/mL）X與其所得峰面積（Arear）Y作標準曲線圖，線性范圍為1～100（μg/mL）回歸方程為y=52.510*x+30.544，相關系數(shù)R=0.9993，在此范圍內(nèi)線性關系良好，可以用于準確定量。

2.4 精密度試驗取對照品工作液，連續(xù)進樣6次，測定喹烯酮對照品工作液峰面積，RSD為0.34%，表明分析方法符合精密度的要求。

2.5 回收率試驗按“2.1.4”方法操作，測定樣品中喹烯酮的含量，結果見表1，回收率在80～110%之間，表明回收率較好，該方法符合要求。

表1 回收率實驗結果（n=6）

2.6 穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，在室溫下放置1、6、12、24、48h后，測定試樣中喹烯酮的峰面積，RSD為0.86%（n=5）。

2.7 樣品測定取飼料樣品，每批按“2.1.4”方法制備3份平行樣，按2.2色譜條件注入HPLC，測定樣品中喹烯酮的峰面積，外標法計算樣品含量，結果喹烯酮含量為51.4（mg/kg）。

3 討論與結論

3.1 測定波長的選擇取喹烯酮標準儲備液,用流動相稀釋成5μg/mL工作溶液,以流動相為空白,在220～360nm波長,用紫外分光光度計作雙波長掃描,找其最大特征吸收峰,喹烯酮在260nm波長最大吸收峰，因此選擇260nm為測定波長。

3.2 流動相流速的優(yōu)化考察了流動相流速的分析效果，分別為：0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min，結果表明流速為1.0mL/min分離度大于1.5，分離效果最好，因此選擇流動相流速為1.0mL/min。

3.3 流動相的選擇與優(yōu)化以甲醇、水為流動相，改變甲醇的比例對樣品進行分離實驗，結果表明，流動相中甲醇含量減小，其對溶質(zhì)與固定相之間氫鍵作用的競爭能力減弱，溶質(zhì)在固定相上的保留逐漸增強，分離度逐漸增大。但由于溶質(zhì)保留太強，導致分析時間過長，樣品擴散嚴重，喹烯酮只獲得部分分離，在流動相中加入極性較小但溶解性很好的乙腈，按甲醇、乙腈、水(25：20：55)比例，增加溶質(zhì)在流動相中的溶解度，縮短分析時間。

3.4 流動相PH值選擇通過添加不同量磷酸調(diào)節(jié)溶液pH值進行實驗，隨著磷酸濃度的增大，pH值減小，當PH值為3.0，喹烯酮完全分開,且峰型對稱,出峰時間比較理想，說明流動相中PH值的改變對溶質(zhì)能否發(fā)生異構體分離具有一定影響。

3.5 樣品前處理條件的優(yōu)化有報道用乙腈作為提取液，采用恒溫震蕩方法提取時間為30min,本實驗分別設計流動相為提取液，采用超聲波提取方法，結果發(fā)現(xiàn)，超聲波提取方法時間只要3min，而且回收率高于恒溫震蕩方法，回收率最高。

3.6 結論試驗采用高效液相色譜法測定飼料中喹烯酮，通過對檢測波長、提取方法、流動相進行選擇與優(yōu)化，應用到實際樣品檢測，該方操作簡便易行，快速準確，節(jié)約測試成本，適用于飼料中喹烯酮的含量檢測。