劉鼎闊 李源 胡鵬程 劉潔 劉芳

1.鼎正新興生物技術(shù)(天津）有限公司 300383

2.天津市飼用微生物制劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3003833

3.天津市企業(yè)技術(shù)中心 300383

中藥大黃有清熱瀉火、攻積滯、解毒等功效。主要包括游離蒽醌、萘類、兒茶酚、沒(méi)食子鞣苷、番瀉苷等成分，游離蒽醌中主要含有大黃素、蘆薈大黃素大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚。有效成分主要集中在蒽酮類、蒽醌類、蒽醌衍生物類等，具有超過(guò)160種化學(xué)成分結(jié)構(gòu)。通過(guò)傳統(tǒng)的煎煮工藝對(duì)大黃中的蒽醌成分進(jìn)行提取，提取率非常低，而且長(zhǎng)時(shí)間高溫還會(huì)導(dǎo)致蒽醌結(jié)構(gòu)受到破壞，降低藥物效果。有研究顯示，醇提取法提取大黃蒽醌類有效成分方法具有費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)單、提出率較高等優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)比大黃醇提取物與常見(jiàn)的大黃水煎劑對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌的抑菌效果，為今后開(kāi)展大黃提取物的獸藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：大腸桿菌（E.Coli）（bio-69919）、金黃葡萄球菌（bio-52742）（均由天津市飼用微生物制劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）

試驗(yàn)原料：大黃飲片（購(gòu)自甘肅鑫晟源生物科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司）、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等。

試驗(yàn)設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化挑取大腸桿菌和金黃葡萄球接種于NB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)活化24h，培養(yǎng)液于4℃離心5min，12000r/min，將上清液通過(guò)0.2μm 微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.2.2 大黃醇提液的制備大黃飲片粉碎，過(guò)60目篩，稱取50g，加入100mL無(wú)水乙醇，浸泡12h-16h后，于85℃-90℃下加熱2h，將藥液過(guò)濾，收集濾液。濾渣加入80mL無(wú)水乙醇，于85℃-90℃下加熱2h，二次過(guò)濾并收集濾液。合并兩次濾液，置于50℃烘箱干燥至相對(duì)密度1.01mg/mL。以pH7.2、0.05mol/L滅菌的磷酸鹽緩沖液稀釋大黃乙醇提取物至1%、3%、5%、7%及9%，備用。

1.2.3 大黃水煎劑制備大黃飲片粉碎，過(guò)60目篩，稱取50g，加水浸泡1h后于煎鍋中煮沸，再文火煎制30min，將藥液過(guò)濾，濾渣通過(guò)上述方法再進(jìn)行兩次煎煮，將濾液合并，5000r/min離心10min，旋轉(zhuǎn)濃縮至1.0g/ml，紫外滅菌，4℃冰箱備用。

1.2.4 抑菌效果

1.2.4.1 對(duì)比大黃醇提取物與大黃水煎劑抑菌效果 分別用制備的大黃醇提取物與大黃水煎劑對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，每組設(shè)置3組重復(fù)，通過(guò)t檢驗(yàn)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)比抑菌效果。

1.2.4.2 不同濃度大黃醇提取物抑菌效果比較 分別用1%、2%、5%、10%大黃醇提取物對(duì)對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，每組設(shè)置3組重復(fù)，通過(guò)單因素方差分析法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)比抑菌效果。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)比大黃醇提取物與大黃水煎劑抑菌效果如圖1、2、3所示，大黃醇提物對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌均有顯著抑制作用，且對(duì)大腸桿菌的抑菌性優(yōu)于金黃葡萄球菌（P≤0.05）。大黃水煎劑對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌開(kāi)始有抑制效果，但抑菌圈界限不明顯，且隨后抑菌圈內(nèi)再次出現(xiàn)細(xì)菌。

圖1 大黃醇提物對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌的抑菌效果

圖2 大黃醇提取物與大黃水煎劑對(duì)大腸桿菌抑制作用

圖3 大黃醇提取物與大黃水煎劑對(duì)金黃葡萄球菌抑制作用

2.2 不同濃度大黃醇提取物抑菌效果比較

如圖4、5所示，大黃醇提取物對(duì)大腸桿菌及金黃葡萄球菌抑菌效果隨濃度的升高顯著增強(qiáng)，大黃醇提取物濃度為5%時(shí)對(duì)大腸桿菌抑菌性最強(qiáng)，濃度為3%時(shí)對(duì)金黃葡萄球抑菌性最強(qiáng)。

圖4 大黃醇提取物對(duì)大腸桿菌抑菌效果

圖5 醇提取物對(duì)金黃葡萄球菌抑菌效果

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)大黃醇提物及大黃水煎劑的抑菌性進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)大黃醇提物對(duì)畜禽養(yǎng)殖中常見(jiàn)的大腸桿菌及金黃葡萄球菌具有明顯的抑制作用，而普通大黃水煎劑抑菌性較差。大黃對(duì)多種致病菌具有抑制作用，可通過(guò)抑制病原菌生物膜和蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抗菌作用。有研究表明，大黃中的大黃素可以通過(guò)抑制菌體糖及糖代謝中間產(chǎn)物的氧化、脫氫、脫氨，并與之結(jié)合，干擾其模板功能，從而抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成，抑制金黃葡萄球菌生物膜相關(guān)基因的表達(dá)及干預(yù)細(xì)胞DNA的釋放，最終抑制其生長(zhǎng)。

由于醇提可以使大黃中的有效成分達(dá)到較大程度利用，降低用藥成本，因此，對(duì)于畜禽動(dòng)物養(yǎng)殖具有廣泛應(yīng)用前景。