卞齊豪，孫文聰，曾 崢，王煥然，王 倩，翁亞軍，陳俊英

(1. 西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2. 西南交通大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

0 引 言

內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells， ECs)位于血管壁的最內(nèi)側(cè)，是血管壁內(nèi)膜層重要的功能性細(xì)胞(圖1(a))[1]。血管受損導(dǎo)致ECs功能障礙乃至被結(jié)構(gòu)性破壞，是引發(fā)一系列疾病的關(guān)鍵誘因[2]。因此，通過(guò)促進(jìn)血管損傷處周圍正常的ECs增殖遷移，實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)皮化是血管修復(fù)的關(guān)鍵所在。此外，由于體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境，具有良好靶向性的材料是修復(fù)血管受損處ECs的基礎(chǔ)。

不同于非磁性納米顆粒，F(xiàn)e3O4-NP在外加磁場(chǎng)的作用下可定向朝目標(biāo)移動(dòng)(圖1(b))。因此，在生物材料領(lǐng)域，研究者們通過(guò)在Fe3O4-NP上搭載特定的藥物或者生物因子，使其應(yīng)用于生物傳感器[3]、磁共振成像[4-6]、示蹤成像標(biāo)記[7]、藥物靶向運(yùn)輸[8-9]及基因傳遞[10]等領(lǐng)域。但研究者[11-12]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將一定濃度的Fe3O4-NP和ECs共培養(yǎng)24h后，納米顆粒會(huì)誘發(fā)ECs功能障礙，降低ECs的一氧化氮(NO)水平以及內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)的活性，同時(shí)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)并伴有炎癥的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致ECs凋亡和壞死。這嚴(yán)重阻礙了Fe3O4-NP應(yīng)用于心血管及ECs修復(fù)領(lǐng)域(圖1(c-1)。此外，由于表面能高以及相互間的磁性作用，F(xiàn)e3O4-NP易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，這不利于納米顆粒在體內(nèi)進(jìn)行靶向運(yùn)輸?shù)哪康摹Ｒ虼?，需要?duì)Fe3O4-NP進(jìn)行表面改性，以改善其性質(zhì)[13]。

將功能性物質(zhì)引入納米顆粒進(jìn)行表面改性是當(dāng)前主要的改性手段[14-20]。其中，蛋白質(zhì)修飾納米顆?？娠@著提高其生物相容性，然而引入后不可避免地會(huì)影響蛋白功能的穩(wěn)定(圖1(c-2))[21]。多肽作為一類由蛋白質(zhì)水解而成的生物活性小分子，具有更簡(jiǎn)單穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。通過(guò)多肽修飾，納米顆粒能獲得更穩(wěn)定的功能(圖1(c-3))。2012年，Kanie[22]從細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原中篩選出三肽分子，半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸 (Cys-Ala-Gly，CAG) 多肽。Kanie通過(guò)將CAG多肽引入到材料表面，發(fā)現(xiàn)CAG多肽對(duì)ECs具有很強(qiáng)的親和性。Kuwabara[23]也通過(guò)將CAG多肽引入人工血管，并用其替代SD大鼠的頸動(dòng)脈。在移植到體內(nèi)1周后，CAG多肽改性后的材料表面即可達(dá)到64.4%的內(nèi)皮化，6周后比例上升至97.4%，并且發(fā)現(xiàn)在相同時(shí)間點(diǎn)上，改性后的材料內(nèi)皮化程度均明顯高于未改性的材料。

本研究以Fe3O4-NP為基礎(chǔ)，通過(guò)表面改性手段，將CAG多肽引入到納米顆粒表面，獲得Fe3O4-CAG(圖1(d-1))。對(duì)改性的Fe3O4-CAG進(jìn)行材料學(xué)表征，通過(guò)多種手段對(duì)顆粒的大小、電位、分散性、磁性性能及多肽的含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探究改性前后納米顆粒對(duì)于細(xì)胞活性、增殖及遷移的影響，從而為Fe3O4-NP進(jìn)一步應(yīng)用于心血管治療領(lǐng)域提供參考(圖1(d-2))。

圖1 ECs在維持血管壁穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的作用(a);磁性與非磁性納米顆粒進(jìn)行靶向運(yùn)輸?shù)牟煌?b)；Fe3O4-NP對(duì)ECs的影響及其表面改性手段的對(duì)比(c)；CAG多肽修飾Fe3O4-NP的設(shè)計(jì)及其在體內(nèi)的靶向治療(d)Fig 1 Role of ECs in maintaining homeostasis of blood vessel walls (a); difference of targeted transport of magnetic and non-magnetic nanoparticles (b); effect of Fe3O4-NP on ECs and comparison of surface modification methods (c); design of CAG peptide-modified Fe3O4-NP and targeted therapy in vivo (d)

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料及設(shè)備

Fe3O4-NP(aladdin)、3-縮水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(KH560，aladdin)、CAG多肽 (吉爾生化(上海)有限公司)等。

DLS激光粒度儀、傅里葉變換紅外光譜、酶標(biāo)儀、倒置熒光顯微鏡、恒溫水浴鍋等。

1.2 CAG多肽修飾Fe3O4-NP

原理如圖2所示。取一定量Fe3O4-NP加入乙醇溶液，超聲分散后按1∶2.5(g/mL)比例將Fe3O4-NP和KH560混合，70 ℃環(huán)境下機(jī)械攪拌，冷凝回流反應(yīng)5 h后除去未參與反應(yīng)的KH560，收集制備好的納米顆粒。修飾前后的納米顆粒分別標(biāo)記為Fe3O4和Fe3O4-EG。

取一定量的Fe3O4-EG，加入無(wú)水乙醇中超聲分散。按環(huán)氧基與CAG多肽的摩爾比1∶2的比例，向溶液中加入CAG多肽，混合后向溶液中加入NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.5。在80℃條件下機(jī)械攪拌，冷凝回流反應(yīng)5 h后除去上述實(shí)驗(yàn)中未參與反應(yīng)的CAG多肽，得到的顆粒加入無(wú)水乙醇中保存。樣品標(biāo)記為Fe3O4-CAG。

圖2 納米顆粒環(huán)氧基化及CAG多肽修飾Fe3O4-NPFig 2 Nanoparticle epoxylation and CAG peptide modified Fe3O4-NP

1.3 CAG修飾前后的Fe3O4的傅里葉變換紅外光譜

取Fe3O4、Fe3O4-EG和Fe3O4-CAG進(jìn)行干燥，干燥完畢后與溴化鉀研磨壓片。壓片后進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)。

1.4 Fe3O4-CAG表面CAG多肽的含量

圖3為5,5＇二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)檢測(cè)巰基的原理示意圖。采用文獻(xiàn)[24]的方法，依次配制標(biāo)準(zhǔn)CAG多肽溶液、DTNB標(biāo)準(zhǔn)溶液及DTNB分析溶液。向6個(gè)離心管中各加入2 mL DTNB分析溶液，置于25 ℃中水浴。另取5個(gè)離心管，按體積為100、140、220、300、380 μL分別向其中加入CAG多肽標(biāo)準(zhǔn)液，并用緩沖液稀釋2 mL，計(jì)算每個(gè)離心管中CAG多肽的濃度。之后取各離心管中稀釋的溶液400 μL，分別加入DTNB分析溶液中，空白對(duì)照組則加入400 μL的緩沖液，反應(yīng)1 0min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在412 nm處的吸光度值，計(jì)算出CAG多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

稱量一定質(zhì)量m(g)的Fe3O4-CAG分散溶于緩沖液中，之后稀釋至2 mL液體，取400μL加入處理后的DTNB分析溶液中，反應(yīng)10 min，測(cè)量其在412 nm處吸光度，并依據(jù)式(1)計(jì)算Fe3O4-CAG中CAG多肽的含量。

(1)

C為Fe3O4-CAG中CAG多肽的含量(mol/g)；n為CAG多肽物質(zhì)的量(mol)；m為Fe3O4-CAG的質(zhì)量(g)

圖3 DTNB檢測(cè)巰基原理Fig 3 Principle of DTNB detection of thiol group

1.5 CAG修飾前后的Fe3O4的水合粒徑及Zeta電位

取等量的Fe3O4、Fe3O4-EG和Fe3O4-CAG溶于RO水中，在DLS激光粒度儀中檢測(cè)3組樣品的水合粒徑和Zeta電位。

1.6 CAG修飾前后的Fe3O4的磁性變化

取等量的Fe3O4和Fe3O4-CAG，加入到RO水中進(jìn)行超聲分散10 min后用磁鐵對(duì)溶液中的顆粒進(jìn)行吸附，觀察溶液中納米顆粒的吸附情況。

1.7 CAG修飾前后的Fe3O4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

1.7.1 樣品的準(zhǔn)備

用磁性分離除去Fe3O4-CAG中的無(wú)水乙醇。取等質(zhì)量的Fe3O4和Fe3O4-CAG進(jìn)行紫外滅菌。之后將Fe3O4和Fe3O4-CAG各自加入細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至相同濃度。

1.7.2 細(xì)胞培養(yǎng)

向24孔板中每孔加入1萬(wàn)單位數(shù)量的ECs，再按100、200、400 μg/mL的顆粒濃度，分別加入Fe3O4和Fe3O4-CAG，空白對(duì)照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基。在5% CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)1天。

1.7.3 細(xì)胞活性檢測(cè)及染色

培養(yǎng)1天后，去掉舊培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基(n(CCK-8) ∶n(細(xì)胞培養(yǎng)基)=1∶9)，在37 ℃和5% CO2條件下孵育4 h，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm處的吸光度值。用0.9%NaCl生理鹽水洗掉殘留的培養(yǎng)基和樣品，加入5%戊二醛固定過(guò)夜。加入工作濃度為5 μg/mL的羅丹明染色15 min，染色完畢后干燥，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形貌及數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)其單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng)率。

1.8 外加磁場(chǎng)下的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)如圖4所示，在孔板上培養(yǎng)ECs 1～2天，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用無(wú)血清的培養(yǎng)基固定1天。用自制的1mL槍頭垂直在孔板中劃出一條直線，用0.9% NaCl生理鹽水清洗未貼壁的細(xì)胞后，在明場(chǎng)顯微鏡下觀察各劃痕并標(biāo)記。之后按照(M：Magnetic、N：Nanoparticles;1-存在、0-不存在)M0-N0、M1-N0、M1-N1分別加入細(xì)胞培養(yǎng)基、外加磁場(chǎng)和顆粒濃度為200 μg/mL Fe3O4-CAG。在5% CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)1天。培養(yǎng)1天后，用0.9% NaCl生理鹽水洗掉培養(yǎng)基和顆粒，在明場(chǎng)顯微鏡下觀察各組標(biāo)記處劃痕，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移距離。

圖4 ECs遷移實(shí)驗(yàn)Fig 4 ECs migration experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 CAG修飾前后的Fe3O4的傅里葉變換紅外光譜

圖5為CAG修飾前后的顆粒表面結(jié)構(gòu)特征變化的紅外光譜。由圖可見，584 cm-1為Fe3O4的特征吸收峰，3 440 cm-1處為-OH的伸縮振動(dòng)峰，這表明Fe3O4上存在-OH，可與硅烷偶聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)，1 635cm-1處為C=O的伸縮振動(dòng)峰,說(shuō)明Fe3O4還存在羧基等雜質(zhì)基團(tuán)。在1 097 cm-1處出現(xiàn)明顯的Si-O的特征吸收峰，1 465 cm-1出現(xiàn)C-H的特征吸收峰，而Fe3O4上無(wú)這類特征峰的出現(xiàn)，這類特征峰是來(lái)源于KH560。這說(shuō)明硅烷偶聯(lián)劑KH560成功引入到納米顆粒表面。

通過(guò)對(duì)比Fe3O4-EG和Fe3O4-CAG的紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)，3 440和1 635 cm-1處的峰明顯加強(qiáng)，這說(shuō)明Fe3O4-CAG中羧基含量上升。1 313 cm-1處出現(xiàn)-SO2-的特征峰，此為CAG多肽上的巰基被氧化所致。在1261 cm-1處，出現(xiàn)新的-OH特征峰，以及在1 398 cm-1處出現(xiàn)C-N的伸縮振動(dòng)峰，表明Fe3O4-EG表面的環(huán)氧基成功開環(huán)，并與CAG多肽上的氨基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。綜合上述結(jié)果，可以證明CAG多肽已成功引入到納米顆粒表面。

圖5 Fe3O4,Fe3O4-EG和Fe3O4-CAG的紅外光譜(R1: Fe3O4-EG；R2:CAG多肽)Fig 5 FT-IR of Fe3O4, Fe3O4-EG and Fe3O4-CAG (R1: Fe3O4-EG; R2: CAG peptide)

2.2 Fe3O4-CAG表面CAG多肽的含量

圖6為通過(guò)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)的擬合，得到的CAG多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該擬合方程為Y=0.0887+3.5080X，其中Y代表的是412 nm處吸光度值的大小，X代表的是CAG多肽濃度的多少。其擬合度R2=0.997，R2越接近1，說(shuō)明該擬合曲線的擬合度越好，所得到的擬合方程越為可信。通過(guò)測(cè)定Fe3O4-CAG的吸光度值，代入到擬合方程中進(jìn)行計(jì)算，得到CAG物質(zhì)的量，再根據(jù)式(1)計(jì)算出結(jié)果，得到Fe3O4-CAG上多肽的含量為8.77·10-5mol/g。

圖6 CAG多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 6 CAG peptide standard curve

2.3 CAG修飾前后的Fe3O4的水合粒徑及Zeta電位

三組樣品的水合粒徑分別為559、453.6和384 nm(圖7)。Fe3O4由于表面能較高以及磁性納米顆粒間相互的磁性作用，在水溶液環(huán)境中很容易發(fā)生團(tuán)聚，因而其水合粒徑偏大。隨著KH560和CAG多肽的引入，納米顆粒間距增大，降低了納米顆粒相互的影響，使得分散性有所提高，水合粒徑有所下降。

三組納米顆粒表面均帶負(fù)電，Zeta絕對(duì)值低， Fe3O4-EG和Fe3O4-CAG相對(duì)于Fe3O4，Zeta電位的絕對(duì)值有所下降。Fe3O4表面含有-OH，但顆粒分散性較差，因而測(cè)得的Zeta絕對(duì)值相對(duì)較低。在引入CAG多肽的過(guò)程中，一方面過(guò)量消耗了顆粒表面的負(fù)電基團(tuán)，另一方面顆粒表面未反應(yīng)的負(fù)電基團(tuán)被覆蓋。從而造成Fe3O4-CAG的Zeta絕對(duì)值降低。

圖7 Fe3O4,Fe3O4-EG和Fe3O4-CAG的水合粒徑及Zeta電位Fig 7 Hydration particle size and Zeta potential of Fe3O4, Fe3O4-EG and Fe3O4-CAG

2.4 CAG修飾前后的Fe3O4的磁性變化

通過(guò)觀察分散后的溶液狀態(tài)(圖8)，發(fā)現(xiàn)Fe3O4分散性較差，短時(shí)間內(nèi)會(huì)發(fā)生團(tuán)聚、沉降。而CAG多肽修飾后，F(xiàn)e3O4-CAG分散性有所提高，未有明顯的團(tuán)聚沉降。與水合粒徑結(jié)果相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明了由于CAG多肽的引入，一方面納米顆粒間距加大，另一方面顆粒間磁性相互作用降低，從而增加顆粒的分散性。

圖8 外加磁場(chǎng)對(duì)Fe3O4和Fe3O4-CAG的影響Fig 8 Effect of Fe3O4 and Fe3O4-CAG under external magnetic field

外加磁場(chǎng)后，F(xiàn)e3O4發(fā)生定向移動(dòng)，溶液變得清澈。而Fe3O4-CAG在外加磁場(chǎng)作用下也能定向移動(dòng)，但溶液渾濁，說(shuō)明其中存在分散的Fe3O4-CAG。該結(jié)果說(shuō)明，CAG多肽的引入仍能保留納米顆粒的磁性性能，但會(huì)造成磁性下降。

2.5 CAG修飾前后的Fe3O4對(duì)ECs活性及其增殖率的影響

培養(yǎng)一天后的ECs熒光圖(圖9(A))結(jié)果顯示，隨著顆粒濃度的提高，F(xiàn)e3O4組細(xì)胞數(shù)量明顯少于空白組，ECs未鋪展。Fe3O4-CAG組的細(xì)胞數(shù)量先上升后下降，ECs鋪展較好。隨濃度的提高，F(xiàn)e3O4組的ECs活性呈明顯下降趨勢(shì)，而Fe3O4-CAG組則是先上升后下降(圖9(B))。Fe3O4直接與ECs接觸，誘導(dǎo)細(xì)胞功能障礙，從而影響ECs細(xì)胞活性。濃度為100～200 μg/mL時(shí)， Fe3O4-CAG組的細(xì)胞活性明顯高于Fe3O4組的，該結(jié)果具有極顯著性差異。引入CAG多肽后，一方面避免Fe3O4與ECs直接接觸，另一方面CAG多肽的內(nèi)皮細(xì)胞親和性，提高了Fe3O4-NP的細(xì)胞相容性。在兩方面作用下，F(xiàn)e3O4-CAG組的ECs活性有顯著的上升。但400 μg/mL濃度下，F(xiàn)e3O4-CAG組活性卻有明顯下降。這可能是因?yàn)樵诟邼舛拳h(huán)境下，顆粒所呈現(xiàn)的細(xì)胞毒性對(duì)ECs的影響超過(guò)CAG多肽的作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞活性下降。

圖9 不同濃度下，F(xiàn)e3O4和Fe3O4-CAG與ECs培養(yǎng)一天后的細(xì)胞熒光圖(a)、細(xì)胞活性(b)和ECs增殖率(c)(**P<0.01 表示與Fe3O4有極顯著性差異)Fig 9 ECs cell fluorescence, CCK-8 values and proliferation rate of culture with Fe3O4 and Fe3O4-CAG at different concentrations after one day (** P<0.01 represents a very significant difference compared with Fe3O4)

統(tǒng)計(jì)單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算各濃度下，各組樣品對(duì)ECs增殖率的影響(圖9(C))。兩組樣品在100 μg/mL濃度下的ECs增殖率分別為185.9%和-42.9%，200 μg/mL濃度下的增殖率分別為187.4%和-83.3%，在400 μg/mL濃度下的增殖率分別為-62.1%和-60.5%。該結(jié)果表明，CAG多肽修飾后的磁性納米顆粒具有良好的促進(jìn)ECs增殖的能力。

2.6 外加磁場(chǎng)作用下，F(xiàn)e3O4-CAG對(duì)ECs遷移的影響

圖10(a)為各組劃痕模型以及培養(yǎng)1天后的劃痕圖。對(duì)于劃痕遷移距離的界定，選取各組劃痕兩側(cè)最外側(cè)和最內(nèi)側(cè)。24 h后，在同一位置，劃定24 h細(xì)胞遷移虛線，計(jì)算最外側(cè)和最內(nèi)側(cè)的遷移距離，取平均值即代表各組樣細(xì)胞的遷移距離(圖10(b))。

M0-N0組的遷移距離為238.9 μm，而M1-N0組的遷移距離下降到97.3 μm，下降的比率達(dá)59.3%(圖10(b))。有文獻(xiàn)表明[25]， 外加恒定磁場(chǎng)對(duì)ECs會(huì)產(chǎn)生不利影響，暴露在恒定磁場(chǎng)下24 h的ECs增殖受到影響，其活性抑制達(dá)32.9%～65.8%。M1-N1組的遷移距離達(dá)到319.0 μm，與M0-N0組相比，遷移距離上升33.5%，相較于M1-N0組有顯著性差異。一方面，在CAG多肽環(huán)境下，ECs細(xì)胞活性加強(qiáng)，細(xì)胞增殖加快；另一方面，在外加磁場(chǎng)作用下，F(xiàn)e3O4-CAG朝劃痕中心處聚集，CAG多肽吸引劃痕兩側(cè)的ECs朝聚集處黏附遷移。使得M1-N1組的細(xì)胞遷移距離和遷移增長(zhǎng)率明顯上升。

圖10 劃痕24 h前后細(xì)胞遷移圖(a)和細(xì)胞遷移距離及其增長(zhǎng)率(b)(*P<0.05，與M1-N0組有顯著性差異)Fig 10 Cell migration map, cell migration distance and growth rate before and after scratching in each group for 24 h (* P <0.05, significantly different from the M1-N0 group)

3 結(jié) 論

(1)本文借助與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)將環(huán)氧基引入到磁性納米顆粒表面，通過(guò)環(huán)氧基開環(huán)與CAG多肽的氨基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，成功地將CAG多肽接枝到納米顆粒表面，制備出CAG多肽修飾的磁性Fe3O4納米顆粒，即Fe3O4-CAG。

(2)Fe3O4-CAG在磁性性能未受顯著影響的同時(shí)提高了分散性。

(3)CAG多肽修飾明顯改善了納米顆粒的細(xì)胞相容性。同時(shí)在外加磁場(chǎng)作用下，F(xiàn)e3O4-CAG可促使ECs朝目標(biāo)位置定向遷移。

(4)由于CAG多肽發(fā)現(xiàn)較晚，國(guó)內(nèi)外均無(wú)CAG多肽對(duì)ECs影響機(jī)制的研究，因此本研究?jī)H針對(duì)CAG多肽的效果和功能進(jìn)行設(shè)計(jì)和探索，未對(duì)機(jī)制進(jìn)一步地探討。

(5)本研究為磁性納米顆粒在心血管系統(tǒng)及血管修復(fù)中的研究與應(yīng)用提供了一種新的思路及手段。