戴永發(fā)，李健玲，覃翡，李森，蘇柳靜，蔡斌斌，伍思穎，潘亞錦，鐘曉戈

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 高血壓病區(qū)，廣西 南寧 530021）

高血壓是一種常見的嚴重危害人類健康的心血管疾病，其發(fā)病機制復雜，涉及多個系統(tǒng)。其中，交感神經過度激活是高血壓發(fā)病的基礎環(huán)節(jié)之一，而腎臟作為交感神經感受器和效應器，在腎- 交感調節(jié)軸中扮演著雙重角色，并與中樞交感神經系統(tǒng)整合共同參與血壓的調節(jié)。去甲腎上腺素（Norepinephrine, NE）是大多數交感節(jié)后神經纖維和腎上腺髓質嗜鉻細胞釋放的一種兒茶酚胺類物質，可作用于心血管系統(tǒng)的α 受體引起高血壓[1]。臨床研究發(fā)現，年輕的高血壓前期患者已存在腎神經NE 釋放的升高[2]。腎臟交感神經系統(tǒng)，特別是最靠近腎動脈壁的腎交感傳出和傳入神經對高血壓的產生和維持起決定性作用。臨床研究顯示，去腎動脈交感神經消融術后，高血壓患者整個機體、兩側腎臟的NE 含量和肌肉交感神經活性均顯著降低，提示去腎動脈交感神經消融術可能通過降低腎臟及全身的交感神經活性而發(fā)揮其降壓作用[3]。然而腎交感神經對血壓調控作用的實驗和臨床研究主要集中在腎臟本身的作用，涉及去腎動脈交感神經對神經內分泌系統(tǒng)影響的鮮有報道。腎上腺髓質和下丘腦是重要的神經內分泌器官。腎上腺髓質是體內NE 的重要來源，其分泌活動受到下丘腦和脊髓等高級中樞的調控[4]。因此，去腎動脈交感神經消融術可能是通過影響神經內分泌系統(tǒng)使高血壓患者機體NE水平下降。為證實這一猜想，本研究采用苯酚消蝕法復制去腎動脈交感神經大鼠模型，通過應用高效液相色譜- 熒光檢測法（HPLC-FD）檢測血清、腎組織、腎上腺和下丘腦NE 含量，以及觀察兒茶酚胺合成的限速酶——酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）染色情況，探討去腎動脈交感神經對神經內分泌系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

SPF 級12 周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠16 只，隨機分為去腎神經組（RDNX組）、假手術組（Sham組），并取相同周齡的雄性對照Wistar 大鼠（WKY）8 只為正常對照組（WKY 組）。所有大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，適應性飼養(yǎng)2 周后進行實驗。

RDNX 組大鼠根據參考文獻[5]，予以2% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后行去雙側腎交感神經術，用溶于95% 乙醇的10%（V/V）苯酚溶液分別涂抹兩側腎動脈周圍2 min。Sham 組和WKY 組大鼠進行相同的麻醉和手術解剖過程，采用生理鹽水替代苯酚溶液涂抹腎動脈周圍。各組大鼠術前及術后采用Tail-Cuff 法測量心率（HR）、血壓，術前3 d 采用眼球后靜脈叢取血法取血。術后2 周予以水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，經腹主動脈采血約8 ml，并分別取腎臟、腎上腺和下丘腦組織，一部分組織放入液氮保存，另一部分組織10% 中性甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋。

1.2 HPLC-FD 檢測血清及組織NE 含量

高效液相色譜儀（LC-20A）購自日本島津公司。色譜柱：Waters C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：室溫；泵壓：15 000 kPa ；流動相：甲醇-0.1 mol/L KH2PO4；流速 ：0.8 ml/min ；激發(fā)波長 ：254 nm ；發(fā)射波長：338 nm。采用外標法進行定量分析，NE 標準品購自美國Sigma 公司。色譜分析前，血清樣本400 μl 加入200 μl 高氯酸（0.1 mol/L）渦漩震蕩混勻，4℃靜置15 min，取上清液進行檢測。組織樣本1 mg加入20 μl 高氯酸（0.1 mol/L）進行組織勻漿，4℃低溫離心（12 000 r/min，10 min），取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μl 樣品進樣檢測。

1.3 免疫組織化學法檢測TH 的表達

用免疫組織化學二步法對下丘腦和腎上腺石蠟包埋組織進行染色，切片厚度3 μm。TH 抗體（BA1454）購自武漢博士德生物工程有限公司，工作濃度1 ∶50 ；即用型二步法免疫組織化學檢測試劑盒（PV-9000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。組織切片常規(guī)脫蠟、水化后，予以3% 過氧化氫封閉，阻斷內源性過氧化物酶，然后枸櫞酸修復液高壓修復。滴加TH 抗體孵育過夜。次日磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后滴加生物素標記二抗體孵育，20 min 后PBS 沖洗再加入鏈親和素辣根過氧化物酶孵育。最后DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。陰性對照以山羊血清代替一抗進行染色。結果判斷：在光學顯微鏡下腎上腺髓質細胞和下丘腦視旁核神經元細胞胞漿出現棕黃色顆粒為陽性表達，對細胞進行形態(tài)觀察和細胞計數，計算陽性細胞百分比。

1.4 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數± 標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，若方差不齊多組間比較用方差分析的Welch 法檢驗，進一步兩兩比較用Games-Howell 法，相關性分析采用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 去腎動脈交感神經對血壓參數及HR 的影響

3 組大鼠術前收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、平均動脈壓（MAP）和HR 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），RDNX 組 和Sham 組 術 前SBP、DBP、MAP 和HR 均高于WKY 組（P＜0.05），而RDNX 組與Sham 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組大鼠術后SBP、DBP、MAP 和HR 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），RDNX 組和WKY 組術后SBP、DBP和MAP 均 低 于Sham 組（P＜0.05）， 而RDNX 組 與WKY 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；RDNX組和Sham 組術后HR 均高于WKY 組（P＜0.05），而RDNX 組與Sham 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。術后2 周，RDNX 組SBP、DBP、MAP 均明顯下降。3 組大鼠SBP、DBP、MAP 術前與術后差值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而3 組大鼠HR 術前與術后差值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；經兩兩比較，RDNX 組大鼠SBP、DBP 和MAP 術前和術后差值均大于Sham 組和WKY 組（P＜0.05），而Sham 組大鼠SBP、DBP、MAP 術前與術后差值與WKY 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1、2。

2.2 去腎動脈交感神經對大鼠血清NE 含量的影響

3 組大鼠術前血清NE 含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中RDNX 組和Sham 組術前血清NE 含量均高于WKY 組（P＜0.05），而RDNX 組與Sham 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組大鼠術后血清NE 含量比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中Sham 組術后血清NE 含量均高于RDNX 組和WKY 組（P＜0.05），而RDNX 組與WKY 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組大鼠血清NE 含量術前和術后差值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），RDNX 組大鼠血清NE 含量術前和術后差值均大于Sham 組和WKY 組（P＜0.05），而Sham 組血清NE 含量術前和術后差值與WKY 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3 和圖1。

表1 各組大鼠血壓參數及HR 的比較 （n =8，±s）

表1 各組大鼠血壓參數及HR 的比較 （n =8，±s）

注：①與WKY 組比較，P ＜0.05；②與Sham 組比較，P ＜0.05；③與RDNX 組比較，P ＜0.05。

組別SBP/mmHg DBP/mmHg MAP/mmHg HR/（次/min）術前 術后 術前 術后 術前 術后 術前 術后RDNX 組 165±7① 118±7② 123±7① 85±6② 137±6① 96±7② 443±37① 409±34 Sham 組 162±5① 157±11 116±9① 118±10 130±7① 131±10 412±42① 414±43 WKY 組 118±6 109±1② 92±13 81±6② 97±6 89±8② 348±32 332±18②③F 值 152.040 42.413 55.216 38.125 86.906 36.423 13.634 15.220 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組大鼠血壓及HR 差值比較 （n =8，±s）

表2 各組大鼠血壓及HR 差值比較 （n =8，±s）

注：①與Sham 組比較，P ＜0.05；②與WKY 組比較，P ＜0.05。

組別 SBP 差值/mmHg DBP 差值/mmHg MAP 差值/mmHg HR 差值/（次/min）RDNX 組 47±11①② 37±7①② 41±8①② 43±39①②Sham 組 9±9 -1±10 2±9 1±73 WKY 組 9±9 6±9 8±8 15±32 F 值 40.829 43.401 46.463 1.343 P 值 0.000 0.000 0.000 0.283

2.3 MAP 與血清NE 水平的相關性

MAP 與血清NE 水平呈正相關（r=0.615，P=0.000）。見圖2。

2.4 術后各組大鼠腎臟、下丘腦及腎上腺組織NE 含量的比較

術后2 周3 組大鼠腎臟的NE 含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Sham 組術后腎臟NE 含量均高于RDNX 組和WKY 組（P＜0.05），而RDNX組與WKY 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3 組大鼠術后下丘腦NE 含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），經兩兩比較，Sham 組大鼠術后下丘腦NE含 量 均 高 于RDNX 組 和WKY 組（ 均P＜0.05）， 而RDNX 組術后下丘腦NE 含量與WKY 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組大鼠術后腎上腺組織的NE 含量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Sham 組術后腎上腺組織的NE 含量均高于RDNX 組和WKY組（P＜0.05），而RDNX 組術后腎上腺的NE 含量與WKY 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表3 各組大鼠血清NE 含量的比較（n =8，ng/mg，±s）

表3 各組大鼠血清NE 含量的比較（n =8，ng/mg，±s）

注：①與WKY 組比較，P ＜0.05；②與Sham 組比較，P ＜0.05。③與RDNX 組比較，P ＜0.05。

組別 術前血清NE 含量術后血清NE 含量手術前后NE 含量差值RDNX 組 22.32±9.09① 14.02±2.37② 9.42±9.02 Sham 組 21.07±6.79① 23.04±8.77 1.47±7.89③WKY 組 14.03±4.21 13.41±3.95② -0.24±4.14③F' / F 值 5.636 17.885 3.895 P 值 0.016 0.000 0.036

圖1 去腎動脈交感神經前后各組大鼠血清NE 含量（±s）

圖2 血清NE 與MAP 的相關性

2.5 去動脈腎交感神經對下丘腦及腎上腺組織TH表達的影響

TH 的免疫組織化學結果顯示，術后2 周RDNX組、Sham 組和WKY 組大鼠的下丘腦視旁核細胞TH蛋白陽性表達百分比的均值分別為（16.22±2.51）%、（30.35±4.33）% 和（14.16±2.73）%，3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=35.87，P=0.000），經兩兩比較，Sham 組下丘腦視旁核細胞TH 蛋白陽性表達百分比均大于RDNX 組和WKY 組（P＜0.05），而RDNX 組與WKY 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

表4 各組大鼠術后2 周腎臟、下丘腦及腎上腺組織NE 含量的比較 （n =8，ng/mg，±s）

表4 各組大鼠術后2 周腎臟、下丘腦及腎上腺組織NE 含量的比較 （n =8，ng/mg，±s）

注：? 與Sham 組比較，P ＜0.05。

組別 腎臟NE 含量 下丘腦NE 含量 腎上腺組織NE 含量RDNX 組 0.91±0.21? 1.52±0.43? 271.80±50.10?Sham 組 1.34±0.18 2.95±0.67 371.48±76.62 WKY 組 1.00±0.24? 1.34±0.37? 288.36±20.90?F / F' 值 18.229 17.235 4.806 P 值 0.000 0.000 0.029

術后2 周RNDX 組、Sham 組和WKY 組腎上腺髓質細胞TH 蛋白陽性表達百分比的均值分別為（21.31±2.52）%、（47.56±5.17）% 和（27.11±2.15）%。3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F'=47.931，P=0.000），經兩兩比較，Sham 組腎上腺髓質細胞TH 蛋白陽性表達百分比均大于RDNX 組和WKY 組（P＜0.05），而RDNX 組與WKY 組比較， 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖3 各組大鼠下丘腦視旁核細胞TH 蛋白陽性表達 （SP×400）

圖4 各組大鼠腎上腺髓質細胞TH 蛋白陽性表達 （SP×400）

3 討論

隨著人口老齡化和城鎮(zhèn)化進程的加快，中國心血管病的發(fā)病人數在逐年增加。根據《中國心血管病報告2018》，我國高血壓患病人群已達2.45 億，治療控制率與既往相比雖然有明顯提高，為37.5%，但高血壓的防治工作仍然很嚴峻，尤其是頑固性高血壓的治療，目前仍是困擾臨床的難點[6]。頑固性高血壓的發(fā)病機制目前仍不明確，認為是多因素導致的，其中交感神經的過度激活發(fā)揮著重要作用。流行病學研究提示，合并肥胖、糖尿病、腎功能不全等交感神經活性增加的患者更容易出現降壓藥耐受和需要聯合多種藥物降壓治療的情況[7]。

本研究中采用的自發(fā)性高血壓大鼠是一種遺傳性高血壓大鼠，是目前國內外公認的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動物模型，相比于Wistar 大鼠其具有更高的血壓、更快的HR 和更高的血漿兒茶酚胺濃度，且對各種降壓藥物和降壓處理敏感，近年來被大量用于去腎神經治療的實驗研究[8]。神經阻斷術常采用化學制劑、射頻消融、外科手術等方式，主要用于癌性疼痛和坐骨神經痛的治療。其中化學性神經阻斷術是在神經纖維附近注射化學制劑使得神經纖維變性壞死，以達到神經阻斷的目的。常用的化學制劑有乙醇、苯酚、銨鹽溶液等。苯酚自上世紀20 年代開始就被用作一種神經溶解劑，濃度＞5% 的苯酚溶液可引起蛋白質變性和組織壞死，起效比酒精更快且對組織的刺激性更小[9]。本研究采用溶于95% 乙醇的10% 苯酚溶液行去腎動脈交感神經，術后自發(fā)性高血壓大鼠血壓明顯下降，血清NE 含量顯著降低。

NE 是大多數交感節(jié)后神經纖維釋放的遞質，某器官NE 含量反映該器官交感神經系統(tǒng)的活性。研究者給予犬腎動脈長期注射NE，引起MAP 持續(xù)升高，給予α 腎上腺素能受體阻滯劑——酚妥拉明治療后血壓恢復正常[10]。本研究發(fā)現，RDNX 組大鼠術后血壓下降，同時其腎組織NE 含量較Sham 組顯著降低，提示去腎動脈交感神經可以降低自發(fā)性高血壓大鼠腎交感神經活性。

在胚胎發(fā)育上，腎上腺髓質嗜鉻細胞和交感神經節(jié)細胞的來源相同，這使得腎上腺髓質嗜鉻細胞既有腺細胞的特性又有神經細胞的特點。腎上腺髓質嗜鉻細胞可分泌腎上腺素和去甲腎上腺素作用于心臟和血管的α 和β 受體，使心輸出量增加，血壓升高，參與應激反應[11]。KORNER 等[12]研究表明交感腎上腺系統(tǒng)α 腎上腺素能受體激活是自發(fā)性高血壓大鼠高血壓發(fā)生及其靶器官結構改變的原因之一。TH 是兒茶酚胺類物質合成的限速酶，所以TH 含量可間接反映組織交感神經活性。有研究表明自發(fā)性高血壓大鼠腎上腺TH活性和mRNA 表達量增多與其高血壓的發(fā)生有關，通過給予抗TH 反義脫氧核苷酸治療后，自發(fā)性高血壓大鼠血壓顯著降低，與此同時其腎上腺的兒茶酚胺含量及TH 活性和蛋白表達量也顯著下降[13-14]。本研究顯示，RDNX 組大鼠在去腎動脈交感神經2 周后，其腎上腺NE 含量和腎上腺髓質細胞TH 蛋白表達量較Sham 組大鼠顯著降低，提示去腎動脈交感神經可降低自發(fā)性高血壓大鼠交感腎上腺系統(tǒng)交感神經活動。

下丘腦室旁核是體內重要的神經內分泌和自主神經調節(jié)中樞，內臟的感覺刺激經過復雜的去甲腎上腺素能通路整合到下丘腦，最后產生相應的傳出信號調節(jié)腎臟和其他外周器官的交感神經活性。有學者研究發(fā)現刺激腎傳入神經增加大鼠下丘腦室旁核神經元放電頻率，去腎動脈交感神經可使左心衰大鼠下丘腦室旁核神經元活動減少，全身交感神經活性下降[15]。本研究顯示，去腎動脈交感神經后自發(fā)性高血壓大鼠下丘腦中NE 含量和TH 蛋白表達減少。說明術后自發(fā)性高血壓大鼠下丘腦交感神經活性降低，提示去腎動脈交感神經可通過影響下丘腦的交感神經活動，使自發(fā)性高血壓大鼠血壓下降。

綜上所述，去腎動脈交感神經不僅使自發(fā)性高血壓大鼠腎臟交感神經活性下降，同時也降低自發(fā)性高血壓大鼠腎上腺和下丘腦等神經內分泌器官的交感神經活性，使交感腎上腺系統(tǒng)和自主神經調節(jié)中樞交感活動減少，而后者可能是導致自發(fā)性高血壓大鼠在去腎動脈交感神經后血壓下降的更深層的因素。