錢秀娟，陳琳，章文明，2，周杰，2，董維亮，2，信豐學(xué)，2，姜岷，2

（1南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京211816；2南京工業(yè)大學(xué)江蘇先進生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心（SICAM），江蘇 南京211816）

通過傳統(tǒng)代謝工程手段提高單菌發(fā)酵性能，為大宗和高附加值化學(xué)品的高效生物合成提供了廣闊前景［1］。然而，在構(gòu)建工程菌株過程中，外源基因受到的排他性和基因沉默途徑的存在以及發(fā)酵過程需要的嚴格培養(yǎng)條件等因素，制約了生物制造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［2-3］。在自然環(huán)境中，99%以上的微生物無法通過傳統(tǒng)的技術(shù)進行分離培養(yǎng)；天然微生物菌群通過在不同細胞間進行勞動分工，可完成復(fù)雜工作，且對復(fù)雜環(huán)境具有更強的適應(yīng)性和穩(wěn)定性［4］。人類利用微生物混菌體系進行生物發(fā)酵已經(jīng)有幾千年的歷史，如傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中奶酪和醬油的生產(chǎn)是由混合菌群發(fā)酵完成［5］?；炀w系具有的強大優(yōu)勢也正促使合成生物學(xué)的發(fā)展從基本模塊和元件的單菌底盤設(shè)計逐步走向從頭設(shè)計和構(gòu)建人工混菌體系［6］。近年來，研究人員已在微生物混菌體系的應(yīng)用潛力開發(fā)、菌群細胞的勞動分工設(shè)計、細胞間信息互作機制解析以及微生物群落系統(tǒng)統(tǒng)計模型開發(fā)等方面開展了大量的研究工作［7-21］（圖1）。

通過解析天然混菌體系的互作機制，指導(dǎo)理性設(shè)計與構(gòu)建系統(tǒng)魯棒和穩(wěn)定的人工混菌體系為合成生物學(xué)的網(wǎng)絡(luò)化與多功能化研究開辟了新的研究方向。在基因表達方面，復(fù)雜混菌體系為單細胞創(chuàng)造了獨特的生長微環(huán)境，可能會激活常規(guī)單菌培養(yǎng)條件下的“沉默”基因簇，合成新的化學(xué)物質(zhì)，這為新藥的研究開發(fā)提供了廣闊資源［22］。此外，人體內(nèi)的微生物群落行為是影響人類健康的一個重要因素，人體內(nèi)數(shù)以萬億計的微生物伴隨著人類共同進化，與人體共同構(gòu)成了一個復(fù)雜、和諧并具個體特性的共生系統(tǒng)，以適應(yīng)不斷變化的宿主生理［23］。在代謝路徑方面，多細胞體系采用“勞動分工”的方法，減輕了單菌底盤的代謝負擔(dān)，適于完成更復(fù)雜的工作［24-25］。通過菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控可以實現(xiàn)代謝路徑的模塊化組裝和優(yōu)化；而在單菌底盤內(nèi)，代謝路徑的優(yōu)化需要通過一系列關(guān)于啟動子、核糖體結(jié)合位點、終止子和載體等復(fù)雜的基因編輯才能完成［9］。在系統(tǒng)魯棒性方面，多細胞體系集合了不同性狀、不同功能的細胞，細胞間的作用關(guān)系維持著動態(tài)平衡，對環(huán)境波動具有更強適應(yīng)性和穩(wěn)定性，可在復(fù)雜環(huán)境下完成復(fù)雜功能［26］。目前，人工多細胞體系已在醫(yī)療、食品、化工、能源、環(huán)境等多個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，并且取得了一定的進展。

目前，人工多細胞體系的研究還處于起步階段，在設(shè)計與構(gòu)建人工多細胞體系、提升現(xiàn)有多細胞體系的穩(wěn)定性和可控性等方面仍存在巨大挑戰(zhàn)。本文綜述了近年來人工多細胞體系在人體健康監(jiān)測、高附加值化合物合成、木質(zhì)纖維素的一體化生物加工以及環(huán)境生物修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用，重點介紹了人工多細胞體系的構(gòu)建策略與瓶頸、提升人工多細胞體系穩(wěn)定性和可控性等方面，為人工多細胞體系的構(gòu)建及應(yīng)用提供全面深入的剖析與指導(dǎo)。

1 混菌體系在新藥研發(fā)及人體健康監(jiān)測方面的應(yīng)用

圖1 多細胞體系研究進展重要標志成果時間軸Fig.1 A brief timeline for some key milestones in microbial consortia development

1929年，亞歷山大·弗萊明（Alexander Fleming）在Penicillium和Staphylococcus的混菌體系中發(fā)現(xiàn)了青霉素的存在，這被認為是20世紀最有影響力的科學(xué)突破之一［12］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新型化合物在多細胞培養(yǎng)體系中被分離和鑒定。例如，共培養(yǎng)Fusarium tricinctum和F.begonia合成了對Escherichia coli、Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa具有抗菌性的抗生素物質(zhì)Subenniatins A and B［27］。共培養(yǎng)Streptomyces clavuligerus和S.aureusN315可以產(chǎn)生全霉素類抗生素物質(zhì)，而單培養(yǎng)這兩株菌都無法獲得此抗生素［28］?；蚪M測序技術(shù)以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，揭示真菌系統(tǒng)中超過90%次級代謝產(chǎn)物合成的基因簇在常規(guī)實驗室培養(yǎng)條件下處于“沉默”狀態(tài)［29］。例如Amyco-latopsis中的沉默糖肽簇［30］。有研究表明一些“沉默”基因簇的激活需要其他微生物分泌的一些激活因子的刺激［31］。表1總結(jié)了過去10年通過微生物混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的新型化合物，這些新物質(zhì)中大多都表現(xiàn)出抗菌特性，且只能通過混合培養(yǎng)獲得。近年來，抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥性致病菌株的數(shù)量在不斷增加，開發(fā)更多新型的抗生素刻不容緩［37］。多細胞體系的特性顯示了其在抗生素合成方面的潛力。

除了抗生素等新型物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，多細胞體系在臨床研究中也發(fā)揮著重要的作用。人體系內(nèi)的微生物與體細胞一樣豐富，且含有的基因要比人類基因組更加龐大復(fù)雜［38-39］。除了遺傳和環(huán)境因素外，人體微生物群體行為也是影響人類健康的另一個重要因素［22］。例如，腸道菌群已在個性化醫(yī)療中扮演重要角色，對于腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)展和動態(tài)平衡至關(guān)重要［40］。探究人體微生物間及微生物與人體組織間的作用機制是人體微生物組學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)，也是人體健康管理的重要方向。

2 “勞動分工”實現(xiàn)復(fù)雜代謝路徑天然產(chǎn)物的合成

合成生物學(xué)和代謝工程在構(gòu)建和優(yōu)化模型微生物，如E.coli和Saccharomyces cerevisiae的代謝途徑以合成高附加值化學(xué)物方面取得了巨大進展。而人工合成網(wǎng)絡(luò)規(guī)模和復(fù)雜程度的不斷增加，使得利用單菌兼容這些功能成為難題。例如，利用葡萄糖從頭合成紫杉醇需要35～51步。通過基因編輯獲得的E.coli工程菌株最高只能合成1.02 g/L紫杉二烯（紫杉醇的前體）［41］，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。多細胞體系的研究為這類復(fù)雜代謝路徑物質(zhì)的合成提供了新的借鑒和方法。通過理性設(shè)計與構(gòu)建人工多細胞培養(yǎng)體系，將代謝路徑分配組裝到多個獨立細胞，可減輕單菌的代謝負擔(dān)。并且，通過設(shè)計與優(yōu)化單個底盤細胞的代謝能力，可以實現(xiàn)各模塊的最佳組合［7］。

根據(jù)多細胞體系中的微生物組成，可將其分為原核與原核、真核與真核和原核與真核三類組合方式。在原核與原核多細胞體系中，E.coli是最常用的底盤細菌。例如，Zhang等［42］設(shè)計了一種新型E.coli-E.coli共培養(yǎng)體系，生產(chǎn)順，順黏康酸和4-羥基苯甲酸，這兩種化合物都是生產(chǎn)己二酸、對苯二甲酸、肉豆酸和香草醇等高值化合物的重要平臺中間體［43-44］。在這一研究中，第一株E.coli利用葡萄糖合成中間體3-脫氫莽草酸，該中間體隨后被第二株E.coli吸收轉(zhuǎn)化為順，順黏康酸或4-羥基苯甲酸。為了消除這兩個菌株之間的碳源競爭，在第一個菌株中去除了磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，在第二個菌株中刪除了催化D-木糖和D-木果糖相互轉(zhuǎn)化的木糖異構(gòu)酶基因xylA。由此構(gòu)建的人工多細胞體系可以同時利用葡萄糖和木糖。該策略的應(yīng)用成功克服了代謝中間產(chǎn)物積累及底物利用效率低的難題。這一策略還被用于構(gòu)建利用葡萄糖和甘油混合物合成生物聚酰胺所需的原料尸胺［45］，以及利用葡萄糖和木糖混合物合成糖苷等人工多細胞體系中［46］。此外，Zhang等［47］通過將上游和下游途徑融合到兩個獨立的E.coli中，構(gòu)建了一個以甘油為唯一碳源的微生物菌群系統(tǒng)，實現(xiàn)了兩種菌株的生長和順，順黏康酸的產(chǎn)生。同樣，通過混合培養(yǎng)4-乙烯基酚或4-乙烯基兒茶酚合成基因工程菌與氰基-3-O-葡萄糖苷生產(chǎn)菌株，實現(xiàn)了紅酒色素吡喃花青素在E.coli中的首次合成［48］，相比于傳統(tǒng)的植物提取，該方法生產(chǎn)的吡喃花青素更加穩(wěn)定。此外，E.coli混合培養(yǎng)系統(tǒng)還被用于合成多種天然產(chǎn)物，如咖啡酰蘋果酸等酯化合物［49］、α-蒎烯等萜類化合物［50］、白藜蘆醇等多酚化合物［51］等。表2總結(jié)了人工多細胞體系在天然產(chǎn)物合成方面的最新研究成果。

表1 混合培養(yǎng)鑒定新的次生代謝物的最新研究Tab.1 Recent studies on mixed cultures identifying novel secondary metabolites

表2 人工多細胞體系在高附加值化合物生產(chǎn)中的最新研究成果Tab.2 Summary of recent progress in valuable compound production applying synthetic microbial consortia

續(xù)表

相比之下，關(guān)于真核-真核微生物混合培養(yǎng)的研究還較少。比較典型的例子是通過混合培養(yǎng)兩株工程Pichia pastoris，以甲醇為碳源，實現(xiàn)抗高膽固醇血癥的藥物莫納可林J和洛伐他汀的生物合成［57，69］?；炀囵B(yǎng)體系中，洛伐他汀和莫納可林J的產(chǎn)量分別達到250.8 mg/L和593.9 mg/L，與單一培養(yǎng)相比，洛伐他汀的生物合成能力提高了2.2倍，莫納可林J的生物合成能力提高了13.4%。

細菌與真核生物的跨物種混合培養(yǎng)用于天然產(chǎn)物的合成已取得一定進展。Rodríguez-Bustaante等［70］分離到一個由酵母菌（Trichosporon asahii）和細菌（Paenibacillus amyllyticus）組成的微生物混菌體系，其中T.asahii負責(zé)將葉黃素裂解為β-紫羅蘭酮，而P.amyllyticus將β-紫羅蘭酮還原為7，8-二氫-β-紫羅蘭酮和7，8-二氫-β-紫羅蘭醇衍生物，這是煙草香氣中存在的化合物。在另一種工程E.coli和S.cerevisiae的跨種共培養(yǎng)體系中，以葡萄糖為唯一碳源獲得了2 mg/L的含氧紫杉烷（有效的化療藥物）［23］。在這一過程中，E.coli負責(zé)紫杉烯的上游從頭合成，隨后高效表達細胞色素P450的S.cerevisiae將紫杉烯轉(zhuǎn)化為含氧紫杉烷。然而，該混合培養(yǎng)體系中，S.cerevisiae代謝產(chǎn)出的乙醇對E.coli的生長和紫杉烷的合成有顯著的抑制作用。為了優(yōu)化該體系的菌群結(jié)構(gòu)，研究人員設(shè)計了碳源互惠的方式，即木糖被E.coli消耗并轉(zhuǎn)化為乙酸，S.cerevisiae利用乙酸為碳源并將其轉(zhuǎn)化為含氧紫杉烷。經(jīng)過遺傳修飾后，最終獲得了33 mg/L的含氧紫杉烷。最近，Zhang等［68］構(gòu)建了E.coli和S.cerevisiae的交叉培養(yǎng)，內(nèi)源性酪氨酸途徑被導(dǎo)入E.coli，用于高水平生產(chǎn)酪氨酸，隨后由下游工程酵母轉(zhuǎn)化為柚皮素。最終以木糖為碳源轉(zhuǎn)化獲得了21.16 mg/L柚皮素，較酵母單菌發(fā)酵提高了8倍。

除了兩種微生物的相互作用外，研究者也設(shè)計了含有3種或3種以上菌株的復(fù)雜人工多細胞體系。比如，Liu等［64］設(shè)計了一種由E.coli、Bacillus subtilis和Shewanella.oneidensis組成的混菌體系用于微生物發(fā)電。在此過程中，E.coli首先轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)乳酸，乳酸作為碳源和電子供體被B.subtilis轉(zhuǎn)化為核黃素。最后，Shewanella.oneidensis轉(zhuǎn)化核黃素進行產(chǎn)電。另一方面，Shewanella.oneidensis氧化乳酸生成醋酸鹽，可作為E.coli和B.subtilis的碳源。這3種菌株形成了一個交叉喂養(yǎng)的多細胞產(chǎn)電系統(tǒng)，11 mmol/L葡萄糖轉(zhuǎn)化可獲得約550 mV的穩(wěn)定電力并持續(xù)輸出15 d以上。此外，通過構(gòu)建一個由3株E.coli組成的多細胞系統(tǒng)，可用于迷迭香酸的非線性合成；與單一菌株培養(yǎng)相比，迷迭香酸的產(chǎn)量提高了38倍［66］。另一個多細胞體系的例子是花青素的從頭合成，該研究將苯丙酸、黃烷酮、黃烷-3-醇和花色苷生產(chǎn)過程中涉及的15個酶轉(zhuǎn)化步驟分配到4個獨立的E.coli中，實現(xiàn)了黃烷-3-醇的首次異源合成［65］。

雖然多細胞體系在天然產(chǎn)物的合成方面已經(jīng)取得一定的進展，但如何將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。除了菌群結(jié)構(gòu)調(diào)控和培養(yǎng)條件的權(quán)衡優(yōu)化外，還有更多的實際問題需要考慮：①不同微生物組成的混合培養(yǎng)會引起一些次級代謝物的合成，給菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)控、產(chǎn)品的下游分離帶來了更多挑戰(zhàn)；②多細胞體系內(nèi)，細胞之間的交流主要通過物質(zhì)和信號分子的傳遞起作用，如何提高這類物質(zhì)的傳遞和接收效率是提高多細胞體系運作效率的關(guān)鍵；③多細胞體系內(nèi)細胞之間的交流是一個動態(tài)過程，很難實現(xiàn)長期穩(wěn)定生產(chǎn)［9］。因此，從實驗室規(guī)模的角度來判斷多細胞體系的工業(yè)潛力還為時過早。更多的大規(guī)模試驗，特別是長期培養(yǎng)過程有待考察。

3 基于多細胞體系構(gòu)建的木質(zhì)纖維素一體化加工過程

木質(zhì)纖維素是世界上儲量最豐富的可再生資源，是生產(chǎn)生物燃料和化學(xué)品的理想原料。然而，木質(zhì)纖維素的生物煉制是一個復(fù)雜的過程，包括糖化酶的生產(chǎn)、生物質(zhì)的降解以及己糖和戊糖的利用等多個步驟［71］。將這些步驟分開進行將導(dǎo)致高成本和較長的發(fā)酵周期。一體化生物加工過程（consolidated bioprocessing，CBP）通過利用一種微生物或微生物菌群同時完成水解酶的生產(chǎn)、生物質(zhì)原料的降解以及生物化學(xué)品的合成這三大功能，能夠顯著降低木質(zhì)纖維素原料降解轉(zhuǎn)化的成本［72-73］。傳統(tǒng)的CBP系統(tǒng)設(shè)計分為兩類：一是改造木質(zhì)纖維素利用菌株生產(chǎn)化學(xué)品［74-76］；二是在非木質(zhì)纖維素利用菌株中引入木質(zhì)纖維素降解酶［77-79］。然而，無論哪種策略，都無法避免繁重的基因編輯工作［80］。此外，很難找到能夠產(chǎn)生所有木質(zhì)纖維素降解酶的微生物［81］。目前，異源生產(chǎn)的木質(zhì)纖維素降解酶活性僅達到每升幾百個濾紙單位（FPU）［82-84］，而天然的木質(zhì)纖維素利用菌株，如Trichoderma reesei，其木質(zhì)纖維素降解酶活性可達到每升數(shù)萬個濾紙單位。

將多細胞體系應(yīng)用于一體化生物加工過程中，通過混合培養(yǎng)木質(zhì)纖維素降解菌株與目標產(chǎn)品生產(chǎn)菌株，可克服傳統(tǒng)CBP的技術(shù)瓶頸（圖2）。通過共培養(yǎng)T.reesei和Lactobacillisp.可直接利用未解毒的經(jīng)水蒸氣預(yù)處理山毛櫸木材，生產(chǎn)19.8 g/L乳酸，相當于理論最高產(chǎn)量的85.2%［85］。Buzzini［86］設(shè)計了以玉米糖漿低聚糖和糊精為原料生產(chǎn)類胡蘿卜素的Debaryomyces castellii和Rhodotorula glutinis共培養(yǎng)體系。D.castellii水解底物獲得的麥芽糖和葡萄糖，再經(jīng)R.glutinis轉(zhuǎn)化為類胡蘿卜素。在補料分批共培養(yǎng)系統(tǒng)中，以玉米糖漿為碳源可轉(zhuǎn)化獲得8.2 mg/L類胡蘿卜素。通過混合培養(yǎng)工程S.cerevisiae和降解纖維素的放線菌，可實現(xiàn)直接轉(zhuǎn)化未經(jīng)加工的生物質(zhì)，如柳枝稷、玉米秸稈、甘蔗渣和楊樹合成甲基鹵化物［87］。此外，Sgobba等［88］設(shè)計的E.coli和Corynebacterium glutamicum混菌體系，實現(xiàn)了從淀粉直接生產(chǎn)L-賴氨酸及其衍生物。在這一過程中，來自灰鏈霉菌的α-淀粉酶被異源引入E.coli，使其可以利用淀粉作為唯一碳源進行生長代謝。E.coli水解淀粉所產(chǎn)生的葡萄糖繼而用于培養(yǎng)C.glutamicum。另一方面，E.coli為賴氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，C.glutamicum合成并分泌的賴氨酸才能存活。E.coli和C.glutamicum菌形成了一個互惠共生的穩(wěn)定的人工雙細胞體系。

CBP人工多細胞體系目前主要用于能源物質(zhì)的生產(chǎn)，如生物乙醇、生物丁醇、微生物脂質(zhì)和氫氣等。對于生物乙醇的生產(chǎn)，Patle和Lal［89］利用Zymomonas mobilis和Candida tropicalis的混菌體系轉(zhuǎn)化酶解后的木質(zhì)纖維素合成乙醇，收率高達97.7%。T.reesei、S.cerevisiae和Scheffersomyces stipitis的混合培養(yǎng)，可實現(xiàn)纖維素酶生產(chǎn)以及己糖和戊糖同時利用，以未經(jīng)脫毒的稀酸預(yù)處理后的麥草漿為底物可直接用于乙醇的生產(chǎn)［90］。原核與原核、原核與真核以及真核與真核用于生物乙醇、生物丁醇和異丁醇生產(chǎn)的CBP人工多細胞體系都已相繼報道［89，91-93］。Clostridium beijerinckii和C.cellulovorans組成的人工混菌體系，可轉(zhuǎn)化未經(jīng)生物處理的麥草生產(chǎn)3.7 g/L乙醇、14.2 g/L丁醇和5.4 g/L丙酮［94］。在微生物脂質(zhì)生產(chǎn)方面，Papone等［95］通過共培養(yǎng)Chlorellasp.KKU-S2和Toluraspora globosaYU5/2，以甘蔗糖蜜為底物時，細胞生物量達到6.90 g/L，油脂產(chǎn)量達到0.33 g/L。此外，研究人員也設(shè)計和構(gòu)建了CBP人工多細胞體系用于沼氣發(fā)酵和生物氫生產(chǎn)［96-98］。

圖2 木質(zhì)纖維素一體化生物加工人工多細胞體系Fig.2 Schematic illustrations of consolidated bioprocessing strategy for lignocellulose biorefinery using microbial consortia

底物降解速率是CBP過程中的關(guān)鍵限速步驟。加快木質(zhì)纖維素的降解，提高單糖的供給速率是提高CBP降解轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。木質(zhì)纖維素具有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，單一的微生物菌株無法有效地分泌降解木質(zhì)纖維素的所有酶組分。據(jù)報道，微生物共培養(yǎng)可以增加纖維素酶和半纖維素酶復(fù)合體的產(chǎn)量［99］。例如，共培養(yǎng)A.ellipticus和A.fumigatus提高了纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量［100］。Pleurotus ostreatus和Phanerochaete chrysosporium的混合培養(yǎng)體系中，木質(zhì)素分解酶的產(chǎn)量也得到提高［101］。A.oryzae與其他真菌，特別是與P.chrysosporium混合后，α-纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和漆酶的活性都得到了提升［102］。多細胞體系降解酶的總活性并不是單個細胞提供的降解酶活性的總和，甚至?xí)^這個總和。因此，共培養(yǎng)木質(zhì)纖維素降解菌群可以進一步提升木質(zhì)纖維素的降解速率。

4 多細胞體系強化環(huán)境生物修復(fù)

人口的迅速增長帶來了一系列環(huán)境問題，如水質(zhì)惡化、重金屬污染和可溶性磷的損失等［103-105］。生物修復(fù)技術(shù)，即利用特定的微生物吸收、轉(zhuǎn)化、清除和降解環(huán)境污染物，從而清除環(huán)境中的污染物，已在環(huán)境修復(fù)方面取得了一定的成果［106］。然而，利用單一菌株對環(huán)境中的復(fù)雜污染物進行生物降解的效率仍然很低且受到諸多限制［107］。因此，理性設(shè)計與構(gòu)建魯棒性強、穩(wěn)定性好的人工多細胞體系用于生物修復(fù)受到越來越多的關(guān)注。

針對水質(zhì)的富營養(yǎng)化問題，主要的任務(wù)是去除氮元素、磷元素、污染物和毒素等［108］。目前，污水處理的生物工藝包括厭氧消化、硝化和反硝化3個環(huán)節(jié)，并經(jīng)過多輪循環(huán)處理才能達到排放標準，而每一個環(huán)節(jié)的處理都需要配備多個處理池以及大量活性污泥，工藝復(fù)雜，成本投入高［109］。相比之下，微藻群落（微藻和細菌/真菌）為水體修復(fù)提供了一種有效可行的途徑。與僅使用硝化菌相比，共培養(yǎng)Scenedesmus dimorphus和硝化菌可使廢水中氮元素和磷元素的去除率分別提高3.4倍和6.5倍［110］。微藻Chlorella vulgaris和細菌P.putida的共培養(yǎng)對營養(yǎng)物質(zhì)（氮、磷）和化學(xué)需氧量（COD）的去除效率較單菌培養(yǎng)都提升顯著［111］。利用Scenedesmussp.和厭氧污泥共培養(yǎng)對淀粉廢水進行處理，氮和磷的去除率分別達到89%和80%［112］。從共生關(guān)系來看，微藻通過光合作用釋放有機物和O2，而細菌/真菌可以利用這些有機物和O2作為碳源和能源物質(zhì)。同時，細菌/真菌為微藻提供CO2和生長促進因子，如維生素和鐵離子（圖3）［113-114］。在實現(xiàn)污水修復(fù)的同時，收獲的生物質(zhì)還可用作生物燃料、生物化學(xué)品和動物飼料生產(chǎn)的原料［115-117］。盡管微藻與細菌/真菌共生系統(tǒng)展現(xiàn)了諸多優(yōu)勢，但可用的土地、足夠的光照和適當?shù)臏囟热匀粐乐叵拗屏舜松镄迯?fù)技術(shù)在廢水處理方面的應(yīng)用［118］。此外，微藻的回收與處理技術(shù)還不成熟，需要很高的能量投入［118］。為了更好地發(fā)展微藻菌群的生物修復(fù)技術(shù)，還需設(shè)計功能更強大的設(shè)備和開發(fā)更有效的回收技術(shù)。

重金屬，如鋅和鎳，會引起核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，從而被認為是最危險的污染物。盡管已發(fā)現(xiàn)多種具有不同金屬元素去除潛力的微生物［119-120］，但由于廢水中成分的復(fù)雜多樣，使用單一菌株進行金屬去除效率低下。多細胞體系中含有多種魯棒的金屬去除菌株，可以實現(xiàn)金屬的多元同步去除。例如，Scenedesmus quadricauda和Pseudokirchneriella subcapitata共培養(yǎng)能夠去除污水中的Zn2+和Ni2+［121］。Ilamathi等［122］采用海藻酸鈉微珠固定化混合培養(yǎng)酵母與銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌或E.coli，銅、鎘、鉻和鎳的回收率分別達到了84.62%、67.17%、49.25%和61.02%。

偶氮染料是最常用的一類化學(xué)染料，也是一類重要的環(huán)境污染物［123］。普通的物理和化學(xué)方法很難對這些染料進行脫色［124］。雖然特定微生物可以降解偶氮染料，但其降解產(chǎn)物往往是有毒的芳香胺或比母體染料更難降解的代謝物［125］。而人工多細胞體系可通過協(xié)同代謝實現(xiàn)更高程度的生物降解和礦化［126］。例如，橙色二號可以被Enterobacter cloacae和Enterococcus casseliflavus的菌群完全脫色，而E.cloacae和E.casseliflavus單菌對其脫色率分別只有10%和23%［127］。Proteus vulgaris和Micrococcus glutamicus混合培養(yǎng)體系可以在3 h內(nèi)完成對猩紅R的完全脫色，而采用P.vulgaris和M.glutamicus單菌對其進行脫色的時間分別為14 h和20 h［128］。P.vulgaris和Micrococcus glutamicus的混菌體系對磺化活性染料綠HE4BD的脫色率也顯著高于使用單菌培養(yǎng)［129］。

圖3 廢水處理過程中微藻與細菌/真菌的共生關(guān)系Fig.3 Symbiotic relationship between microalgae and bacteria/fungi during wastewater treatment

多細胞體系在降解其他污染物，如殺蟲劑、抗生素和其他毒素方面也顯示出獨特的能力。例如，假單胞菌和葡萄球菌共培養(yǎng)比單獨培養(yǎng)更能有效去除苯酚［130］。Serratia和Trichosporonsp.的共培養(yǎng)，可以完全礦化有機磷殺蟲劑毒死蜱［131］。類似 地，Arthrobactersp.NB1、Serratiasp.NB2和Stenotrophomonassp.NB3NB1組合與單一培養(yǎng)相比，硝基苯的降解效率更高［132］。有研究表明，多細胞體系對多環(huán)芳烴（PAH）的去除效率也高于單一培養(yǎng)物［133］。

5 多細胞體系內(nèi)的信號交互機制

為深入探究多細胞系統(tǒng)內(nèi)細胞間的信息互作機制，還需從信號分子、物理接觸以及基因突變等方面進行深入研究。微生物可以產(chǎn)生并分泌一些關(guān)鍵信號化合物，如N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）和小肽，在“群體感應(yīng)”（quorum sensing，QS）中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和表觀遺傳修飾物調(diào)控微生物的生物學(xué)功能［134］。AHL是革蘭氏陰性菌群內(nèi)的主要信號分子［135］。當環(huán)境中的AHL濃度達到閾值水平，它們會激活LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。LuxR/AHL復(fù)合物可以激活多個基因的表達，其中包括負責(zé)合成AHL的基因［134］。該QS調(diào)控機制已成功應(yīng)用于E.coli-E.coli的混合培養(yǎng)中，通過控制細胞的生長和死亡速率，可實現(xiàn)菌群內(nèi)部結(jié)構(gòu)的可控調(diào)節(jié)［136-138］，或減少物種之間的底物競爭［8］。在革蘭氏陽性菌群內(nèi)，一些小肽物質(zhì)（或叫自身誘導(dǎo)肽，autoinducing peptide，AIP）是主要的QS分子［135，139］。與AHL不同，這些小肽在序列和結(jié)構(gòu)上各不相同，且需要通過專門的轉(zhuǎn)運蛋白進行分泌和吸收［140］。AIP調(diào)控的QS系統(tǒng)通常采用一種雙組分的基因調(diào)控機制——膜結(jié)合的AIP受體組氨酸激酶（HK）和DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)器。當環(huán)境中的AIP達到一定濃度后，就會被HK受體磷酸化并導(dǎo)入細胞內(nèi)。磷酸化的AIP會結(jié)合到目標DNA上以調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄［140］。QS交流模式不僅存在于同屬性的微生物間，在真核微生物和原核微生物之間，也存在QS傳遞系統(tǒng)。例如，通常在真菌/細菌混合培養(yǎng)系統(tǒng)中可發(fā)現(xiàn)苷色酸衍生物，苷色酸在真菌和細菌的信息交流過程中也扮演著重要的角色［141-142］。綜上所述，通過理性設(shè)計與構(gòu)建菌群內(nèi)QS信號分子生產(chǎn)者和接受者，可實現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)的可控調(diào)節(jié)。

上述QS分子都是在環(huán)境中自由擴散并通過濃度響應(yīng)機制實現(xiàn)信息的傳遞，而有些QS分子的運輸需要借助特殊的傳播載體。例如，長鏈AHL等疏水信號需要通過膜泡（membrane vesicle，MV）完成在細胞間的傳遞［143］。而在某些情況下，信息的交互還依賴于菌群內(nèi)細胞的密切接觸。典型的案例就是A.nidulans與放線菌的密切接觸促使了聚酮化合物的合成［142］。在基因?qū)用妫炀囵B(yǎng)會導(dǎo)致基因丟失、組蛋白修飾和水平基因轉(zhuǎn)移等一系列基因表型變化。例如，Streptomyces clavuligerus與Staphylococcus aureusN315共培養(yǎng)會導(dǎo)致S.clavuligerus中一個占基因組大小21%的1.8 Mbp的質(zhì)粒丟失。而另一方面，S.clavuligerus獲得了合成全霉素的能力［28］。推測認為，S.clavuligerus基因片段的缺失減輕了細胞代謝過程中基因復(fù)制和表達的負擔(dān)。作為回報，沉默的全霉素合成途徑被特異性地激活。細菌也可以通過主要的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（Saga/Ada）誘導(dǎo)組蛋白修飾來改變真菌基因的表達［144］。一般來說，組蛋白乙酰化與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，因而可調(diào)節(jié)基因表達。此外，基因水平轉(zhuǎn)移也是菌群信息交流的常見現(xiàn)象?；蚪M分析顯示，Rhodococcus307CO在微生物組合系統(tǒng)中含有一個來自鏈霉菌的較大DNA片段，導(dǎo)致產(chǎn)生新的紅鏈霉素A和B的異構(gòu)體抗生素［145］。

微生物群體內(nèi)部的信息交互是一個非常復(fù)雜的過程。目前，最有效的途徑是通過表征微小混菌體系，降低其復(fù)雜性，并通過檢測特定的中間代謝物或引入報告菌株，構(gòu)建具有代表性的混菌模型庫。相應(yīng)地，先進的預(yù)測和分析技術(shù)，如宏基因組學(xué)、系統(tǒng)生物成像質(zhì)譜、微流控技術(shù)、細胞分離和打印、高通量培養(yǎng)等技術(shù)的發(fā)展，也可指導(dǎo)混菌體系的理性設(shè)計、構(gòu)建與調(diào)控。

6 人工多細胞體系的設(shè)計與構(gòu)建

當前的人工多細胞體系研究還比較簡單，通常只是共培養(yǎng)兩種或三種微生物。此外，共培養(yǎng)體系的構(gòu)建還相對隨機，體系的構(gòu)建及研究尚處于初期嘗試階段，缺乏理論指導(dǎo)。設(shè)計與構(gòu)建一個系統(tǒng)魯棒、穩(wěn)定和可控的人工多細胞體系需要經(jīng)歷構(gòu)建、調(diào)控、重構(gòu)和強化等多個階段，逐級解決每個階段面臨的挑戰(zhàn)是多細胞體系研究最有效的方式。

如何實現(xiàn)不同菌種在同一個封閉系統(tǒng)內(nèi)的穩(wěn)定共存是構(gòu)建多細胞體系的前提。多細胞體系內(nèi)的各類細胞通常具有不同的生長特性，如溫度、pH和氧濃度等。為了協(xié)調(diào)細胞生長條件的不匹配等情況，采用順序接種培養(yǎng)以滿足不同菌株對于生長條件（如溫度和pH）的需求是最常用的方法［146］。然而，順序培養(yǎng)導(dǎo)致發(fā)酵時間延長，產(chǎn)品生產(chǎn)強度降低。近年來，采用生物材料或特殊的發(fā)酵設(shè)備為菌群內(nèi)的細胞創(chuàng)造獨立適合的微環(huán)境，平衡多細胞體系內(nèi)個體細胞生長與代謝環(huán)境，已受到越來越多的關(guān)注。例如，微囊和液滴微流控技術(shù)已被用于為單個細胞創(chuàng)造相對最佳的生長微環(huán)境，每個細胞在空間上獨立培養(yǎng)，避免造成交叉影響［147-148］。此外，在生物反應(yīng)器中設(shè)計一個進氣口，其上包裹一層致密的氣體滲透膜或其他營養(yǎng)物質(zhì)的選擇透過性膜，可以實現(xiàn)氣體或營養(yǎng)成分的梯級分布，實現(xiàn)體系內(nèi)各類細胞的有序分布和培養(yǎng)［149］。

合理的菌群結(jié)構(gòu)和底物分配是實現(xiàn)多細胞體系穩(wěn)定高效運作的關(guān)鍵。調(diào)整菌群內(nèi)不同細胞的接種量和接種時間是調(diào)整種群結(jié)構(gòu)最直接、最有效的方法。然而，如果多細胞體系補給相同的碳源時，會存在底物競爭，這將導(dǎo)致每個物種在菌群中的生長不受控制。目前，常用的思路是設(shè)計幾條平行代謝路徑，使菌群內(nèi)不同細胞專一性地利用不同的碳源，減輕底物造成的生長競爭。例如，在不同的微生物中分別構(gòu)建只利用戊糖和己糖的代謝途徑［33］。這不僅可以消除底物競爭，而且可以實現(xiàn)木質(zhì)纖維素水解液中混合糖的同步利用。另一種途徑是構(gòu)建基質(zhì)和中間體的順序利用模式。例如，單糖可以首先被第1種微生物代謝成中間代謝物，如乙酸等。然后，無單糖利用能力的另一菌株可以以這些中間代謝物為碳源進行生長代謝，并合成最終目標化學(xué)品［23］。近年來，隨著對不同菌種間信號傳遞機制的深入了解，通過QS響應(yīng)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細胞生長相關(guān)基因的表達，進而調(diào)控菌群的結(jié)構(gòu)已被證實可行［138］。

高效的傳質(zhì)，包括中間體、能量和輔因子是提升多細胞體系產(chǎn)品合成效率的關(guān)鍵。與單一細胞工廠不同，在多細胞體系內(nèi)，第一個細胞代謝的產(chǎn)物可能是下一個細胞的底物。因此，這類物質(zhì)需要穿過多種膜組織，這也增加了物質(zhì)傳遞的難度。近期，時空有序分布這一概念在多細胞體系的研究中備受關(guān)注。有序的空間分布可以有效調(diào)控菌群的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，提升物質(zhì)、能量和信號的傳遞效率，提升菌群對外界環(huán)境的適應(yīng)性［150-151］。事實上，這種3D菌群結(jié)構(gòu)廣泛存在于自然環(huán)境中。多種微生物共存的厭氧污泥顆粒就是自然界中3D菌群的一個典型案例。產(chǎn)酸菌被包裹在顆粒外面，將復(fù)雜的大分子有機物分解成有機酸，這些有機酸隨后被位于中間層的乙酸菌轉(zhuǎn)化為H2。外層產(chǎn)生的H2和CO2會被最里層的產(chǎn)甲烷菌消耗轉(zhuǎn)化為甲烷［152］。在這一體系中，微生物創(chuàng)造了三層球狀的菌群結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了營養(yǎng)物質(zhì)的按需供給、代謝物的高效傳遞和菌群的“集團作戰(zhàn)”能力。

3D菌群的構(gòu)建可通過自組裝和人工組裝兩種方式完成。自組裝可以在不使用任何結(jié)合劑的情況下將核心細胞固定在另一微生物形成的基質(zhì)中。典型的例子是由細菌Acetobacter aceti和光合微藻Chlamydomonas reinhardtii組成的菌群［153］。在這個系統(tǒng)中，當A.aceti在液體培養(yǎng)中生長時，會在空氣與水界面產(chǎn)生醋酸纖維墊，這種材料可以捕獲C.reinhardtii并為其生長提供營養(yǎng)基質(zhì)，并為A.aceti提供氧氣［153］。另一個例子是廣泛存在的生物膜，通常是微生物為了適應(yīng)惡劣的環(huán)境條件聚集形成的［154］。在生物膜中，細菌生活在自身產(chǎn)生的親水的胞外聚合物（EPS）中，并自我組裝形成一個協(xié)調(diào)的功能群落。在這個群落中，細胞可以分享營養(yǎng)物質(zhì)，并免受環(huán)境中有害因素的影響［155］。至于人工組裝策略，可以通過設(shè)計智能設(shè)備或材料來幫助通過細胞進行空間排列［156］。例如，微流控和微孔裝置已被用于3D菌群的構(gòu)建。此外，通過材料介導(dǎo)，在保證中間物質(zhì)自由交換的前提下為單個物種創(chuàng)造分隔的生長空間也是未來的重點研究方向［157］。例如，利用噴墨打印細胞和明膠的多光子3D打印技術(shù)，已被用于構(gòu)建具有更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多細胞體系［24，158］。

開發(fā)先進的計算分析工具預(yù)測群落行為是多細胞體系研究的另一重要方向［54，148］。Minty等［82］設(shè)計了一個由50個參數(shù)組成的方程模型來描述和預(yù)測E.coli和T.reesei的共生行為，這一模型可以識別木質(zhì)纖維素生產(chǎn)異丁醇過程中的關(guān)鍵參數(shù)，并對共培養(yǎng)的穩(wěn)定性進行深入評估，從而為多細胞體系內(nèi)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的研究與調(diào)控提供更嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)化分析和指導(dǎo)。因此，菌群內(nèi)部作用機理的建模、功能載體材料的引入以及分析預(yù)測計算模型的開發(fā)將成為未來微生物多細胞體系研究的重要方向。

7 展望

多細胞體系通過：①將產(chǎn)物的合成路徑分模塊分工到幾個細胞中，減輕了單個細胞的工作壓力；②實現(xiàn)不同細胞間物質(zhì)、信號和能量的交換與傳遞，促進了菌體生長和產(chǎn)物代謝合成；③組合多種功能細胞，提高了群體對復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)性和魯棒性，以完成更加復(fù)雜的工作。鑒于此，多細胞體系正在醫(yī)藥、制造、環(huán)保、能源等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。但目前人工多細胞體系的構(gòu)建與應(yīng)用仍存在一些局限性。通過培養(yǎng)過程的優(yōu)化、QS的應(yīng)用、時空有序3D菌群結(jié)構(gòu)的設(shè)計以及多細胞體系計算分析工具的開發(fā)與模型的構(gòu)建等策略，從雙菌、三菌等簡單的多細胞體系入手，針對性地解決共生、合作和發(fā)展（work together，work better and work best）三個階段所面臨的挑戰(zhàn)，是今后人工多細胞體系的主要研究方向。隨著人們對生命系統(tǒng)認知的逐漸提升以及生物技術(shù)的不斷發(fā)展，在可預(yù)見的未來，設(shè)計與構(gòu)建穩(wěn)定、魯棒和可控的人工多細胞體系將在更多領(lǐng)域得到應(yīng)用，成為合成生物學(xué)發(fā)展的新的重要方向。