劉林娜，李濤，葛寒宇，陳占國，余堅(jiān)，鄭曉群

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325027）

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukaemia，ALL）是來源于B/T系淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，細(xì)胞分化異常而停滯于早期階段，導(dǎo)致發(fā)熱、貧血、中性粒細(xì)胞減少、血小板減少等臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查異常，尤其當(dāng)異常增殖的腫瘤細(xì)胞浸潤髓外組織時可致中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病或睪丸白血病等[1]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）屬于抗葉酸類的抗腫瘤藥，通過競爭性抑制細(xì)胞內(nèi)二氫葉酸還原酶的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖[2]。大劑量甲氨蝶呤（high-dose methotrexate，HD-MTX）可通過血腦和血睪屏障，是ALL患兒鞏固治療階段的主要化療藥物，對預(yù)后有十分重要的意義，但HD-MTX誘導(dǎo)的不良反應(yīng)常常導(dǎo)致化療的中斷[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因位于染色體1p36.3，編碼葉酸代謝通路中的限速酶，使5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)活性的5-甲基四氫葉酸，也是MTX發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵酶之一[4]。C677T是目前國內(nèi)外研究較多的位點(diǎn)之一，突變后胸腺嘧啶（T）替代了第677位堿基胞嘧啶（C），使編碼的丙氨酸變成了纈氨酸，而使酶活性發(fā)生變化，并且已有研究報(bào)道該變化與多種疾病相關(guān)，其中包括對ALL化療的不良反應(yīng)[5]， 但此結(jié)論尚存爭議。因此，本研究將探討ALL患兒MTHFR C677T基因多態(tài)性與HD-MTX治療后肝功能異常的相關(guān)性，以及對肝功能各指標(biāo)和功能的影響，為患者的個體化用藥提供可靠的參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2017年10月至2020年3月就診于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童血液科ALL患兒66例，年齡1～12歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議》（第四次修訂）[6]，入選標(biāo)準(zhǔn)：①按照細(xì)胞形態(tài)學(xué)-免疫學(xué)-細(xì)胞遺傳學(xué)-分子生物學(xué)（Morphology-Immunology-Cytogenetics-Molecular biology，MICM）診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)；②骨髓形態(tài)學(xué)：原始及幼稚淋巴細(xì)胞≥20%，若不足20%必須經(jīng)分子診斷確定存在ALL致病基因，如ETV6-RUNX1。所有患者經(jīng)VDLD方案誘導(dǎo)化療、CAM或CAML方案早期強(qiáng)化治療后休療2周左右[6]，在使用HD-MTX前均無明顯骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、口腔黏膜損害及肝腎功能異常等。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會審批，征得患兒父母或其法定監(jiān)護(hù)人的知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 advia2400 全自動生化分析儀（德國西門子公司），ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），安捷倫1290高效液相系統(tǒng)和6420系列三重四極串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），ZORBAX Eclipse Plus C18 column色譜柱（美國Agilent公司）。前白蛋白（prealbumin，PA）測定試劑盒（上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）以及膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）測定試劑盒（德國西門子公司），人MTHFR基因檢測試劑盒（武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司），MTX標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%，美國Sigma-Aldrich公司），甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck Millipore公司），甲酸（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）。

1.3 方法

1.3.1 HD-MTX化療方案：所有ALL患兒1/6總量（不超過0.5 g）在1 h內(nèi)靜脈滴注，剩余部分勻速滴注維持23 h，每10～14天1次，共4次。HD-MTX用藥后36 h四氫葉酸鈣解救，并根據(jù)MTX血藥濃度予以調(diào)整。6-巰基嘌呤50 mg/（m2·d），每療程不超過7 d，根據(jù)白細(xì)胞數(shù)調(diào)整劑量。并給予腰椎穿刺+鞘內(nèi)注射、水化堿化、速尿利尿及血藥濃度監(jiān)測。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室檢查：采用實(shí)時熒光定量PCR-探針法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性；根據(jù)《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療規(guī)范（2018年版）》[7]于患兒靜脈滴注HD-MTX后48 h抽取靜脈血，分別檢測血常規(guī)、肝腎功能，并采用高效液相色譜法檢測HD-MTX血藥濃度，此后每24 h檢測1次，直至血藥濃度≤0.25 μmol/L。

1.3.3 不良反應(yīng)評價：ALL患兒HD-MTX治療后不良反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)參照WHO抗癌藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)與分級標(biāo)準(zhǔn)，在HD-MTX使用后48 h開始監(jiān)測血常規(guī)、ALT、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、是否惡心嘔吐以及口腔黏膜損傷情況等，每位患者的每種不良反應(yīng)僅記錄1次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用logistic回歸模型分析MTHFR C677T基因型與HD-MTX各不良反應(yīng)的關(guān)系，2組間計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或者秩和檢驗(yàn)，2組間計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALL患兒臨床特征 將MTHFR C677T基因CC型歸為野生型，共34例，CT+TT型歸為突變型，共32例，2組患兒的年齡、性別、免疫分型、核型、融合基因和危險分層差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 MTHFR C677T基因分型結(jié)果及Hardy-Weinbery平衡檢驗(yàn) FQ-PCR基因分型結(jié)果如圖1所示，66例患兒中野生型（CC）34例，占51.5%，雜合突變型（CT）25例，占37.9%，純合突變型（TT）僅7例，占10.6%。對MTHFR C677T進(jìn)行Hardy-Weinbery平衡檢驗(yàn)后P=0.46（P＞0.05），證明該基因型頻率符合Hardy-Weinbery 定律，即本研究樣本對于總體有一定的代表性。

2.3 MTHFR C677T不同基因型與HD-MTX不良反應(yīng)的關(guān)系 為了校正劑量因素對不良反應(yīng)發(fā)生率的影響，采用logistic回歸分析，以MTHFR C677T不同基因型為自變量，不良反應(yīng)發(fā)生率為因變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：野生型與突變型相比較，骨髓抑制、口腔黏膜損害和胃腸道反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而肝功能異常發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），突變型發(fā)生肝功能異常的風(fēng)險更高，見表2。

2.4 MTHFR C677T不同基因型與肝功能各指標(biāo)的關(guān)系 與野生型相比，突變型血清ALT、AST、CHE含量異常的患兒比例顯著升高（P＜0.05），而其他肝功能指標(biāo)PA、TP、ALB、LDH、GGT以及TBIL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。野生型和突變型ALT或AST異?；純旱腁ST/ALT比值分別為0.89±0.45和0.71±0.30，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 MTHFR C677T不同基因型患兒HD-MTX血藥濃度的差異 為進(jìn)一步探討不同基因型患兒肝功能異常發(fā)生率不同的原因，分別比較不同基因型患兒滴注HD-MTX后48 h、72 h血藥濃度的差異，結(jié)果顯示突變型患兒48 h、72 h血藥濃度均高于野生型患兒 （P＜0.05）。見圖2。

表1 66例ALL患兒臨床特征

圖1 MTHFR C677TFQ-PCR基因分型結(jié)果

表2 MTHFR C677T不同基因型和HD-MTX不良反應(yīng)的關(guān)系

表3 MTHFR C677T不同基因型與肝功能各指標(biāo)的關(guān)系（例）

圖2 MTHFR C677T不同基因型患兒滴注HD-MTX 48 h、72 h血藥濃度的比較

3 討論

HD-MTX常用于ALL患兒化療的鞏固治療階段，但由于其選擇性較差，部分患兒在使用期間會發(fā)生不同程度的肝功能異常，發(fā)生率和嚴(yán)重程度均存在明顯的個體差異，無法用傳統(tǒng)的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)解釋[8]。研究發(fā)現(xiàn)，藥物反應(yīng)會受不同的遺傳背景影響，其中單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是藥物基因組學(xué)中影響藥物反應(yīng)的主要原因[9]。迄今為止，研究與藥物反應(yīng)和毒性相關(guān)的遺傳變異仍然是癌癥化療中的巨大挑戰(zhàn)。近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對MTHFR C677T基因多態(tài)性與HD-MTX治療后肝功能異常的相關(guān)性進(jìn)行分析，但對具體肝功能各指標(biāo)和功能的影響研究甚少。

由于本研究納入的純合突變型（TT）病例數(shù)較少，僅7例，且經(jīng)過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)CT型和TT型各毒副反應(yīng)發(fā)生率以及肝功能各指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此根據(jù)顯現(xiàn)模型將CC型作為野生型，CT+TT型作為突變型，通過校正劑量因素的影響后，發(fā)現(xiàn)突變型發(fā)生肝功能異常的風(fēng)險更高，與HAGLEITNER等[10]的Meta分析結(jié)果一致，說明T等位基因會增加HDMTX治療后的肝毒性，可能機(jī)制為突變后MTHFR熱穩(wěn)定性和活性較野生型均有所降低，導(dǎo)致催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸的功能障礙，間接引起體內(nèi)甲基化水平降低、MTX代謝減慢，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)生肝功能異常的風(fēng)險升高。進(jìn)一步分析不同基因型與肝功能各指標(biāo)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，突變型較野生型血清ALT、AST、CHE含量異常的患兒比例顯著升高，其他相關(guān)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明不同基因型患兒肝實(shí)質(zhì)損害發(fā)生率有差異，而肝臟合成功能、儲備功能、膽紅素代謝功能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。針對ALT或AST異常的患兒，突變型與野生型患兒AST/ALT比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均值都小于1，表明HD-MTX雖對肝細(xì)胞有損害，但對肝細(xì)胞線粒體損傷較輕，使得存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ALT大量釋放入血，ALT升高程度大于AST。本研究發(fā)現(xiàn)突變型患兒48 h、72 h血藥濃度均顯著高于野生型，與XU 等[11]的研究結(jié)論一致。究其原因可能為突變后MTHFR酶活性降低，導(dǎo)致血藥代謝、葉酸代謝以及細(xì)胞修復(fù)減慢。因此，針對突變患兒應(yīng)避免HD-MTX與其他有肝損的藥物同用，且在用藥前后應(yīng)檢查肝功能，對異常者需及時積極治療。

相關(guān)研究認(rèn)為，埃及、亞洲人群中MTHFR C677T基因多態(tài)性與肝臟毒性的風(fēng)險增加相關(guān)[12]，而另一項(xiàng)研究證實(shí)在土耳其和歐洲人群中結(jié)論則完全相反[13]，說明該基因多態(tài)性在不同人種中的表現(xiàn)存在差異。有研究報(bào)道，除HD-MTX誘導(dǎo)的肝功能異常，MTHFR C677T多態(tài)性可能對ALL易感性、預(yù)后等存在影響，JUSTER-SWITLYK等[14]觀察到MTHFR C677T多態(tài)性與MTX引起的脊髓病相關(guān)，而ROY等[15]也發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T突變的兒童葉酸缺乏現(xiàn)象更常見以及在誘導(dǎo)治療期間更易發(fā)生敗血癥引起的死亡。綜上分析，MTHFR C677T在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用依然有待深入研究和探討。除MTHFR C677T位點(diǎn)，MTHFR A1298C、TPMT A719G以及TPMT G460A與HD-MTX血藥濃度、各不良反應(yīng)的相關(guān)性研究較多，然而各學(xué)者研究結(jié)論不一[16]，總體而言，尚不能成為預(yù)測HDMTX治療時肝功能異常的良好指標(biāo)。

綜上所述，MTHFR C677T基因分型有望成為ALL患兒HD-MTX治療時降低肝毒性和改善治療結(jié)果的有效檢測手段。然而本次研究來自單中心，病例數(shù)有限，且單個SNP可提供的信息量較少，需擴(kuò)大病例數(shù)在更多人群中進(jìn)行驗(yàn)證，以期為ALL患兒提供更有價值的個體化用藥指導(dǎo)。