王書(shū)夢(mèng)，吳萌，高曉丹，李婷婷

（麗水市中醫(yī)院 藥劑科，浙江 麗水 323000）

絕大多數(shù)乳腺癌是激素依賴(lài)性惡性腫瘤，其生長(zhǎng)往往與體內(nèi)激素密切相關(guān)[1]。雌二醇是促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要激素，能與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結(jié)合并激活后者的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，從而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）作為人工合成的抗雌激素藥物，可與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)ER，并與ER結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物抑制ER的生物活性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。但隨著研究的推進(jìn)，TAM被證實(shí)還能與新型ER-G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）結(jié)合，觸發(fā)后者下游增殖、遷移、侵襲等相關(guān)信號(hào)分子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[4-5]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是指上皮細(xì)胞失去上皮表型而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過(guò)程，可以使腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力[6]。目前鮮見(jiàn)TAM是否能通過(guò)GPER介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT的研究。本研究以乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞（ER-，GPER+）作為研究對(duì)象，主要觀(guān)察TAM對(duì)該類(lèi)細(xì)胞侵襲能力和EMT的影響，并探討GPER的介導(dǎo)作用，為臨床治療乳腺癌提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與藥品：人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、MDAMB-231細(xì)胞、MDA-MB-468細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；TAM購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司，使用時(shí)以DMSO溶解稀釋?zhuān)籊PER特異性抑制劑G15購(gòu)自德國(guó)Cayman公司，使用時(shí)以DMSO溶解稀釋。

1.1.2 主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、L15 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；GPER siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自上海吉瑪公司；Vimentin抗體、Ecadherin抗體、N-cadherin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPDH抗體、抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自北京愛(ài)必信公司；蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液及總蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器：AI600凝膠成像儀，美國(guó)GE公司產(chǎn)品；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及電源，美國(guó)bio-rad公司產(chǎn)品；OptimaTMXPN超速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品；臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)L400，湖南湘儀公司產(chǎn)品；DXS-5倒置顯微鏡，上海締倫公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞以含15% FBS及1%青-鏈霉素的L15培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、100%空氣的培養(yǎng)箱中；乳腺癌MCF-7細(xì)胞以含10% FBS及1%青-鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中；乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞以含10% FBS及1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 TAM處理和G15干預(yù)：分為空白對(duì)照組（不做任何處理），DMSO組（以0.1% DMSO處理48 h），TAM組[以TAM（5 μmol/L）處理48 h]，G15組[以G15（10 μmol/L）預(yù)處理4 h]，TAM+G15組（先以G15預(yù)處理4 h，再以TAM處理48 h）。

1.2.3 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力：取出分裝好的Matrigel膠，用L15培養(yǎng)基將Matrigel膠稀釋至0.250 mg/mL。吸取100 μL Matrigel膠稀釋液于Transwell小室中，放置到培養(yǎng)箱靜置3～4 h。制備含所需濃度藥物的培養(yǎng)基，用該培養(yǎng)基分別將MDA-MB-468細(xì)胞（必要時(shí)提前用G15預(yù)處理）制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，吸取200 μL細(xì)胞懸液加入各Transwell小室中。在Transwell小室的下室中加入800 μL L15培養(yǎng)基（含20 FBS），置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。48 h時(shí)取出細(xì)胞，傾倒出小室內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS洗2遍，將小室置于甲醇中固定細(xì)胞15 min，PBS洗2遍，再將小室置于0.5%結(jié)晶紫水溶液中染色15 min，將小室在清水中洗2次，取棉簽擦掉小室內(nèi)房細(xì)胞，小室風(fēng)干10 min。倒置顯微鏡下觀(guān)察并取6個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)。

1.2.4 siRNA干擾GPER蛋白表達(dá)：當(dāng)MDA-MB-468細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～90%時(shí)進(jìn)行換液處理，30 min后進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，以250 μL L15培養(yǎng)基溶解5 μL siRNA（包括GPER干擾siRNA和對(duì)照siRNA），輕柔混勻，室溫靜置5 min；再以250 μL L15培養(yǎng)基溶解10 μL Lipofectamin2000，輕柔混勻，室溫靜置 5 min；將溶解好的siRNA和Lipofectamin2000混合制成siRNA-Lipofectamin2000混合物，室溫靜置 20 min后加入細(xì)胞中完成轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后8 h用完全培養(yǎng)基換液。轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA的細(xì)胞設(shè)為siRNA干擾對(duì)照組（siRNA-Con），轉(zhuǎn)染GPER干擾siRNA的細(xì)胞設(shè)為GPER干擾組（GPER-siRNA）。將細(xì)胞置于37 ℃ 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，Western blot檢測(cè)GPER干擾效率。觀(guān)察干擾GPER表達(dá)對(duì)TAM誘導(dǎo)效應(yīng)的影響：分為空白對(duì)照組（MOCK）、siRNA-Con組、TAM+ siRNA-Con組、siRNA-GPER組及TAM+siRNA-GPER組。分別進(jìn)行侵襲小室實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：按照需求處理細(xì)胞，處理結(jié)束后分別以3 mL PBS洗2遍，第2遍PBS保留，用細(xì)胞刮刀將各組細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，1 200 r/min離心5 min，棄去廢液，各加入RIPA細(xì)胞裂解液（含1%蛋白酶混懸顆粒）于冰上裂解10 min，裂解結(jié)束后在4 ℃條件下以12 000 r/min 離心20 min，吸取上清液至0.5 mL EP管中并置于冰上，采用BCA蛋白定量試劑盒定量，定量后制備蛋白電泳樣品。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜30 min，5%脫脂牛奶封閉PVDF膜4 h后分別用GPER（1:2 000）、Vimentin（1:3 000）、E-cadherin（1:2 000）、Ncadherin（1:1 000）或GAPDH抗體（1:5 000）于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次，抗兔IgG-HRP二抗（1:5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色后凝膠成像儀進(jìn)行成像，對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞GPER和ERα表達(dá)水平比較 以MCF-7細(xì)胞（GPER+，ER+）作為陽(yáng)性對(duì)照，MDA-MB-231細(xì)胞（GPER-，ER-）作為陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-468細(xì)胞為GPER陽(yáng)性、ERα陰性，見(jiàn)圖1。

2.2 各組細(xì)胞TAM與G15處理影響細(xì)胞侵襲活動(dòng) 空白對(duì)照組和DMSO組細(xì)胞侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DMSO組比，TAM組細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；與TAM組比，TAM+G15組細(xì)胞侵襲能力顯著減弱（P＜0.01），見(jiàn)圖2。