馮雨露，周樂斌，2，薛向陽，梅勁，3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 解剖教研室，浙江 溫州 325035；2.樂清市人民醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325600；3.寧波市第一醫(yī)院 科研中心，浙江 寧波 315000）

隨著基于以肝、心、肺、腎和神經(jīng)[1-5]等重要器官的去細(xì)胞器官為支架在體外重建獲得階段性進(jìn)展，去細(xì)胞皮瓣也逐漸吸引修復(fù)重建外科領(lǐng)域 研究者們的注意[6]。然而，皮瓣為不均質(zhì)組織，常規(guī)去細(xì)胞的過程存在耗時(shí)長、流程復(fù)雜、條件苛刻等缺點(diǎn)，僅在制備階段就遇到了比實(shí)質(zhì)器官更大的挑戰(zhàn)。本研究的目的是建立一個(gè)簡便可靠的去細(xì)胞方法來制備更具靈活性及臨床適用性的去細(xì)胞皮瓣。

1 材料和方法

1.1 去細(xì)胞皮瓣支架的制備 本研究嘗試了一種制作去細(xì)胞皮瓣的新方案，利用磁力攪拌器產(chǎn)生的不均勻力場來對沖非均質(zhì)的皮瓣組織，以盡量保持皮瓣各組織層的完整性。取健康成年SD大鼠[溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SYXK（浙）2019-0009；雌雄各10只，體質(zhì)量300～320 g]，5%水合氯醛麻醉，沿腹正中線從下至上切開，對稱向背側(cè)剪開，保留3 cm×4 cm大小的皮瓣（圖1A方框處示意為取材部位），暴露股動(dòng)靜脈。進(jìn)行股動(dòng)脈置管（24號留置針），結(jié)扎小動(dòng)脈分支并剪開股靜脈后，注射0.05%的肝素生理鹽水約20 mL，至肉眼觀察到小血管變白。取下去血后的皮瓣，四角束縛于平皿中，表皮層朝向磁珠。平皿內(nèi)含有0.05%肝素鈉生理鹽水，開啟磁力攪拌器低檔旋轉(zhuǎn)。然后依次灌注并震蕩0.05%肝素鈉溶液0.5 h，1% Triton 1～2 h，0.08% SDS 10～12 h，去離子水12 h。

1.2 去細(xì)胞皮瓣支架檢測

1.2.1 HE及DAPI染色：將皮瓣用OCT包埋后，切成7 μm厚的冰凍切片。0.02% PBS沖洗3次，每次 5 min。分別進(jìn)行HE、DAPI染色后顯微鏡下觀察組織內(nèi)結(jié)構(gòu)和殘留細(xì)胞情況。

1.2.2 DNA總量的測量：將對照組皮瓣與去細(xì)胞皮瓣真空冷凍干燥24 h后，稱重，剪碎，按每0.1 g 組織添加1 mL DNA裂解液（100 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、25 mmol/L pH 8.0 EDTA、500 mmol/L NaCl、1% SDS）及2 μL的蛋白酶K，55 ℃水浴過夜。12 000×g室溫離心10 min，取上清液加入等體積異丙醇混勻，冰浴10 min。再次離心，棄上清液， 42 ℃烘箱烘干后用加30 μL雙蒸水溶解DNA沉淀，于微量紫外分光光度計(jì)上測定吸光度，并結(jié)合重量換算DNA總含量。

1.2.3 殘留十二烷基硫酸鈉（SDS）的測量：SDS和亞甲基藍(lán)在酸性條件下產(chǎn)生藍(lán)色化合物。用二氯甲烷萃取藍(lán)色化合物后，通過比色法測定SDS含量。用蛋白酶K消化組織后，將上清液加到亞甲藍(lán)溶液（每100 mL亞甲基藍(lán)水溶液含250 mg亞甲基藍(lán)，50 g 無水硫酸鈉和10 mL濃硫酸）中，將混合物充分混合并用二氯甲烷萃取，棄去上層溶液。向每個(gè)試管中加入無水硫酸鈉，混合并離心。吸出試管中的澄清溶液，在651 nm的波長下測量吸光度。通過測量具有已知SDS濃度的8種溶液的吸光度產(chǎn)生SDS對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算結(jié)果。

1.2.4 掃描電鏡檢查：對照組及去細(xì)胞組皮瓣，分別切成1.0 mm3大小的組織塊，4 ℃ 2.5%戊二醛固定過夜，經(jīng)PBS沖洗，鋨酸處理后固定，醋酸鈾染色后丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋劑浸透，包埋，制作超薄切片，掃描電鏡下觀察。

1.2.5 血管造影：根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行操作。

1.3 皮下植入實(shí)驗(yàn)

1.3.1 動(dòng)物分組：共計(jì)32只2月齡SD大鼠（體質(zhì)量約250 g），其中雌性16只，雄性16只。用5%水合氯醛麻醉后，固定，背部備皮，75%乙醇消毒，于脊背中線切開皮膚全層至深筋膜，打開四個(gè)間距約1 cm的小孔，分離皮下組織，制備皮下囊。對照組（16只大鼠，雌雄各半）皮下包埋4塊未去細(xì)胞皮瓣；實(shí)驗(yàn)組（16只大鼠，雌雄各半）皮下包埋4塊去細(xì)胞皮瓣，所用皮瓣約1 cm×1 cm，包埋前將皮瓣于0.1%青鏈霉素抗生素浸泡24 h。術(shù)后給足糧食和水，不提供任何抗生素治療，定時(shí)觀察切口有無紅腫、感染。術(shù)后第1和第2周，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別隨機(jī)取8只大鼠中的移植物（雌雄各半）進(jìn)行新生血管數(shù)目統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 移植物血管計(jì)數(shù)：取術(shù)后第1周和第2周的移植物，制備厚度為10 μm的冠狀面冰凍切片并進(jìn)行HE染色于光學(xué)顯微鏡下觀察。平均新生血管數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果來自每張切片的10個(gè)高倍鏡（100倍放大）視野。

1.3.3 外周血淋巴細(xì)胞比例：術(shù)后第1、第3、第7和第14天，從大鼠尾靜脈采集外周血樣品，樣品在4 ℃下用肝素鈉抗凝血保存。血液樣品用紅細(xì)胞裂解緩沖液（R1010，北京索萊寶科技有限公司）并按照說明書處理后，將0.5 μL一抗（CD25-PEcy7，25-8484-80，CD4-FITC，11-0040-82，北京eBioscience公司）加入每個(gè)細(xì)胞管中。每管細(xì)胞在4 ℃下避光孵育1 h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞后使用BD FACSCanto II檢測。使用Flow Jo 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，2 組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去細(xì)胞皮瓣支架大體觀察 制備完成的去細(xì)胞皮瓣具有白色不透明的外觀，見圖1B；腹主動(dòng)脈血管造影顯示血管形態(tài)完整，分支清晰可見，見圖1C；掃描電鏡顯示較連續(xù)的蛋白纖維，見圖1D。

圖1 獲取的去細(xì)胞皮瓣表征

2.2 基因組DNA含量檢測 組織基因組DNA（gDNA）含量顯示實(shí)驗(yàn)組DNA的總量比對照組顯著減少95%以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 DNA定量檢測結(jié)果

圖3 收獲的去細(xì)胞皮瓣核染色結(jié)果

圖4 SDS在651 nm處吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 組織學(xué)觀察 DAPI核染色觀察不到明顯的細(xì)胞核，HE染色僅可見紅色的細(xì)胞外基質(zhì)，見圖3。

2.4 殘留SDS的檢測 根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得，去細(xì)胞皮瓣中殘余SDS約（28±4）mg/g，遠(yuǎn)處于生物安全水平（133.3 mg/g[4]）之下，見圖4。

2.5 再生血管計(jì)數(shù) 包埋術(shù)后第1 周，實(shí)驗(yàn)組支架材料與周圍組織界限清楚，包埋支架內(nèi)部見少量炎性細(xì)胞浸潤，包埋支架邊緣可見少量新生血管長入；包埋術(shù)后第2周，支架組織內(nèi)部見大量新生血管，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。第1周和第2周，實(shí)驗(yàn)組新生血管數(shù)明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且炎癥反應(yīng)明顯小于對照組。見圖5。

2.6 外周血中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的比例 術(shù)后第1天2組動(dòng)物的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞較標(biāo)準(zhǔn)對照均大幅下降；但實(shí)驗(yàn)組在第3、第7和第14天調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞群比例均高于對照組（P＜0.05）。提示實(shí)驗(yàn)組大鼠整體的免疫排斥反應(yīng)比對照組弱。見圖6。

圖5 2組血管再生結(jié)果

圖6 去細(xì)胞皮瓣移植后外周血調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例變化

3 討論

與合成材料相比，去細(xì)胞支架不僅保留了較完整的原組織3D結(jié)構(gòu)，還能保存大部分的膠原蛋白、黏連蛋白及纖連蛋白等，能夠調(diào)控細(xì)胞生長分化的細(xì)胞外基質(zhì)成分[8]，本課題組此前報(bào)道證明，去細(xì)胞腎臟支架能有效促進(jìn)腎臟的再生[4]。

隨著去細(xì)胞材料的廣泛應(yīng)用，去細(xì)胞支架的制備方法也逐漸形成體系，包括灌注法和振蕩法[9-10]。 結(jié)合我們過去的嘗試以及對已發(fā)表文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，我們發(fā)現(xiàn)單純使用灌注法進(jìn)行皮瓣組織的去細(xì)胞難以獲得理想結(jié)果，原因可能是皮瓣屬于非均質(zhì)組織，真皮部位疏松而表皮組織致密導(dǎo)致單純使用振蕩法進(jìn)行去細(xì)胞很困難。因此我們對原有方法進(jìn)行改進(jìn)，使用磁力攪拌器進(jìn)行輔助震蕩。方案改進(jìn)后，皮瓣的表皮層可以受到垂直方向和水平方向的兩種力量，而同時(shí)真皮層只接受水平方向的一種力量，所以新方案可以在不影響去細(xì)胞速度的同時(shí)有效地去除皮膚和脂肪組織中的細(xì)胞和油脂成分。

通過該方法制備完成的去細(xì)胞皮瓣僅具有微量核碎片，不影響支架發(fā)揮其優(yōu)秀的生物材料性質(zhì)。血管造影術(shù)證實(shí)，去細(xì)胞皮瓣維持著主要的血管蒂和微循環(huán)網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)果表明，皮膚和脂肪組織ECM的天然3D結(jié)構(gòu)和生化特性不僅在去細(xì)胞支架中得到了很好的維護(hù)，還能為細(xì)胞播種和組織工程提供地圖線索。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組外周血調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例增高。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，移植術(shù)后該群細(xì)胞比例增高程度與宿主對移植物的排斥程度成反比關(guān)系[3]，所以使用該方法制備完成的去細(xì)胞皮瓣能產(chǎn)生低排斥的免疫環(huán)境。

使用磁力攪拌器輔助法制備的去細(xì)胞皮瓣，不僅能較完全地去除細(xì)胞核，還能保留完整的血管網(wǎng)絡(luò)。另外，皮下包埋結(jié)果證實(shí)該支架排斥反應(yīng)低，生物相容性好，且能促進(jìn)血管再生。本方法有助于為類似不均質(zhì)組織的去細(xì)胞支架制備提供參考。