胡翠芳，孔萬仲，陳孟權(quán)，梁敏，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015）

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一種線粒體遺傳性視神經(jīng)疾病，主要累及視網(wǎng)膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束纖維，導(dǎo)致雙眼同時(shí)或先后出現(xiàn)無痛性視力減退，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性病變，同時(shí)可伴有中心視野缺失及色覺障礙[1-2]，發(fā)病人群多為青壯年男性，發(fā)病年齡多見于17～30歲。研究表明LHON家系中50%以上由ND1 G3460A、ND4 G11778A和ND6 T14484C這3個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)引起[3-4]。近年來，除上述3 個(gè)原發(fā)性突變位點(diǎn)外，相繼發(fā)現(xiàn)線粒體ND1T3394C、ND1T3866C、tRNAMetA4435G、 ND4G11696A、ND6T14502C、tRNAGluA14693G、tRNAThrA15951G等突變也可能與LHON的致病相 關(guān)[5-14]。本研究主要對(duì)2個(gè)典型LHON患者及其家系進(jìn)行詳細(xì)眼科相關(guān)檢查、線粒體全基因組分析、種系發(fā)生學(xué)分析及單體型分析，為進(jìn)一步闡明LHON的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 對(duì)來自浙江溫州地區(qū)2個(gè)典型LHON家系進(jìn)行家系調(diào)查，編號(hào)WZ1007和WZ1035，如圖1所示。對(duì)2個(gè)先證者及家系成員進(jìn)一步詢問，并進(jìn)行詳細(xì)的眼科相關(guān)檢查，完善相關(guān)臨床病史資料。同時(shí)選取104例漢族健康受試者作為正常對(duì)照，采集先證者家系和正常對(duì)照人群的EDTA-K2抗凝靜脈血 5 mL。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 眼科學(xué)檢查：對(duì)2個(gè)家系的先證者及其家系中其他成員進(jìn)行臨床眼科檢查，包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)視力表檢測(cè)視力、眼底照相拍片（美國(guó)VOLK D90）、俞自萍色覺圖檢查、電生理儀檢測(cè)視覺誘發(fā)電位（visual evoked potential，VEP）、眼科光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)（OCT檢查儀，德國(guó)Heidelberg公司）等檢查。雙眼視力損傷程度參照WHO標(biāo)準(zhǔn)，正常＞0.3；0.1≤輕度＜0.3；0.05≤中度＜0.1；0.02≤重度＜0.05；極重度＜0.02。

1.2.2 基因組DNA提取：使用外周血DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），提取2個(gè)家系先證者及成員和104例正常對(duì)照的EDTA-K2抗凝靜脈血的全基因組DNA，NanoDrop1000測(cè)定濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析：以先證者及家系成員和正常對(duì)照的基因組DNA為模板，針對(duì)G11778A、G3460A和T14484C這3個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)所在基因片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化后，用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序[15]。同時(shí)，采用二代測(cè)序法對(duì)先證者及家系成員和正常對(duì)照的線粒體基因組進(jìn)行全序列測(cè)序，進(jìn)一步確定線粒體基因組的突變位點(diǎn)，使用Snapgene等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與劍橋參考序列[16-17]進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 種系發(fā)生學(xué)分析和單體型分析：根據(jù) GenBank選取人（Homo sapiens）、牛（Bostaurus）、小鼠（Mus musculus）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）等17 個(gè)不同物種，對(duì)線粒體序列進(jìn)行種系發(fā)生學(xué)分析，計(jì)算mtDNA突變的保守系數(shù)，進(jìn)行保守性分 析[1]。根據(jù)東亞線粒體單體型進(jìn)化樹對(duì)線粒體DNA突變的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行單體型分型。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 2個(gè)LHON家系圖見圖1。WZ1007家系先證者（III-2）17歲時(shí)因雙眼視力同時(shí)下降就診，經(jīng)檢查雙眼視力輕度損失，色覺正常；視野檢查提示視野中心出現(xiàn)暗點(diǎn)；眼底拍照如圖2所示，表現(xiàn)為雙眼視盤偏淡，視乳頭周圍毛細(xì)血管輕微擴(kuò)張；VEP檢查表現(xiàn)為P100峰潛時(shí)延長(zhǎng)，幅值下降；OCT檢查無明顯變化（見圖3）。WZ1035家系先證者（III-2）20歲時(shí)因視力驟降就診，雙眼視力中度損失，色覺正常；視野檢查提示雙眼視野呈現(xiàn)向心性縮小，中心出現(xiàn)暗點(diǎn)；眼底拍照提示杯盤比增大；VEP檢查表現(xiàn)為P100峰潛時(shí)延長(zhǎng)，幅值下降；OCT檢查提示鼻側(cè)和顳側(cè)象限視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層（retinal nerve fiber layer，RNFL）變?。黄淠敢暳χ囟葥p失，但未作其他眼科相關(guān)檢查。2個(gè)先證者經(jīng)臨床檢查均未發(fā)現(xiàn)其他疾病，無其他不良嗜好和外傷史。除WZ1035-II-4外，2個(gè)家系其他成員視力均正常。

圖1 2個(gè)LHON家系圖

2.2 線粒體基因組分析 PCR和測(cè)序分析結(jié)果顯示2個(gè)家系所有成員和正常對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)G3460A、G11778A和T14484C這3個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)。通過二代測(cè)序法對(duì)2個(gè)先證者進(jìn)行線粒體全序列分析，結(jié)果如表1所示，2個(gè)先證者攜帶36個(gè)線粒體基因突變位點(diǎn)，分別位于D-loop區(qū)7個(gè)，12S rRNA 2個(gè)，16S rRNA2個(gè)，tRNA 1個(gè)，蛋白編碼區(qū)24個(gè)，包含10個(gè)錯(cuò)義突變和14個(gè)同義突變，其中10個(gè)錯(cuò)義突變?yōu)椋篘D1基因G4084A（Val260Leu），MT-ND2基因G5460A（Ala331Thr），MT-CO2基因G7853A（Val90Ile），ATP6基因A8701G（Thr59AlaA）和A8860G（Thr112Ala）， MT-ND3基因A10398G（Thr114Ala），MT-ND4基因G11696A（Val313Ile），MT-ND5基因T12811C（Tyr159His），MT-Cytb基因C14766T（Thr7Ile）和A15326G（Thr194Ala），其中ND4 G11696A已報(bào)道是與LHON相關(guān)的線粒體突變位點(diǎn)，其余變異位點(diǎn)通過對(duì)人、牛、小鼠、非洲爪蟾4個(gè)不同物種進(jìn)行保守性分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)先證者同時(shí)攜帶的變異位點(diǎn)中A5834G和T12811C變異位點(diǎn)在進(jìn)化上保守，通過進(jìn)一步對(duì)17個(gè)不同物種mtDNA進(jìn)行保守性分析，發(fā)現(xiàn)A5834G保守系數(shù)為87.5%（見圖4），除T12811C在正常人突變頻率較高外，其余變異位點(diǎn)均不保守，且均已報(bào)道可能與LHON的發(fā)病無關(guān)。同時(shí)2個(gè)家系中其他母系成員均攜帶A5834G突變，而104例正常對(duì)照和家系中非母系成員則不攜帶A5834G突變。根據(jù)東亞線粒體單體型系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，這2個(gè)家系的mtDNA序列均屬于東亞單體型M7b，已有研究證實(shí)M7b會(huì)加重LHON的臨床表現(xiàn)[18]。

圖2 2例先證者的眼底表現(xiàn)

圖3 2例先證者的OCT檢查結(jié)果

3 討論

本研究中2 個(gè)家系的先證者均具有典型LHON 臨床表現(xiàn)，2個(gè)先證者年齡分別為17歲和20歲，符合LHON好發(fā)于青壯年特點(diǎn)，除表現(xiàn)為視力損害外，未發(fā)現(xiàn)其他明顯臨床表現(xiàn)，所有研究對(duì)象經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序均未發(fā)現(xiàn)G11778A、G3460A和T14484C這3個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)。本研究對(duì)這2個(gè)家系進(jìn)行詳細(xì)的臨床評(píng)估及分子遺傳學(xué)特征分析，通過對(duì)線粒體基因組全序列分析，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)家系母系成員均攜帶tRNATyrA5834G突變位點(diǎn)，該突變影響mtDNA tRNATyr基因T-莖中的第65 位堿基，如圖5 所示線粒體tRNATyr的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖，T-莖可作為線粒體DNA重鏈和輕鏈的啟動(dòng)子，編碼多種對(duì)tRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用的功能蛋白[19]。tRNA作為翻譯核心角色，在核酸信息水平和蛋白質(zhì)功能水平間發(fā)揮重要作用，具有高度保守的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[20]，tRNA轉(zhuǎn)錄后修飾的密度在所有RNA中最高，主要集中在反密碼子環(huán)和tRNA核心區(qū)域，從標(biāo)記有tRNA修飾數(shù)據(jù)的釀酒酵母（S.cerevisiae）tRNATyr晶體結(jié)構(gòu)可知（見圖6），其中標(biāo)記紅色的D-loop和T-loop兩個(gè)主要區(qū)域的堿基通過彼此間相互作用來穩(wěn)定第三折疊結(jié)構(gòu)，這些修飾位點(diǎn)的改變可能會(huì)導(dǎo)致tRNA結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的重排或局部微調(diào)[20-21]。目前已有報(bào)道證明參與編碼tRNA且位于tRNA T莖環(huán)處的A14692G、A14693G、C12191T突變位點(diǎn)是LHON相關(guān)的線粒體突變位點(diǎn)[22-23]。線粒體G5834A突變可能會(huì)影響tRNATyr前體的合成和加工過程，引起tRNATyr的空間結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性改變，tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)代謝功能障礙，線粒體相關(guān)蛋白合成和代謝功能障礙，ATP生成減少等一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致高能量需求的視網(wǎng)膜視神經(jīng)發(fā)生病變，引發(fā)LHON。

表1 2個(gè)先證者線粒體DNA全序列突變位點(diǎn)分析

圖4 通過cluster程序?qū)Σ煌锓N中的線粒體tRNATyr基因進(jìn)行序列比對(duì)顯示整個(gè)物種中5 834位G核苷酸的保守性

圖5 線粒體tRNATyrA5834G的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

圖6 含堿基修飾頻率的tRNA結(jié)構(gòu)彩圖

報(bào)道中常用于突變位點(diǎn)致病性的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為：①出現(xiàn)在＜1%的對(duì)照中；②進(jìn)化保護(hù)（保守性）；③潛在的結(jié)構(gòu)和功能變更[24]。本研究的正常對(duì)照中均未發(fā)現(xiàn)攜帶tRNATyrA5834G突變位點(diǎn)，該突變位點(diǎn)在17種生物中高度保守，且可能存在結(jié)構(gòu)和功能的改變，符合線粒體突變的致病標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，已有研究證實(shí)線粒體單體型與LHON的外顯率和致病性嚴(yán)重程度相關(guān)，HUDSON等[25]研究表明線粒體單體型J是歐洲LHON家系的遺傳易感型，YU等[26]發(fā)現(xiàn)單體型F存在T14484C突變加重LHON嚴(yán)重程度的現(xiàn)象，表明某些單體型可對(duì)LHON起有害或保護(hù)作用，JI等[27]在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)M7b2單體型可增加攜帶有G11778A家系的患病風(fēng)險(xiǎn)，本研究中2個(gè)先證者均屬于東亞M7b單體型，提示攜帶A5834G的M7b單體型可能對(duì)LHON臨床表型存在影響。2個(gè)先證者均具有典型LHON臨床表現(xiàn)，2個(gè)先證者發(fā)病年齡分別為17歲和20歲，平均18.5歲，與冀延春等[28]報(bào)道的T12338C突變、QU等[29]報(bào)道的T14484C突變以及ZHOU等[30]報(bào)道的G11696A突變LHON家系（平均18.5歲、18.4歲）接近，也符合LHON好發(fā)于20歲左右青壯年這一特點(diǎn)，A5834G突變的這2個(gè)家系外顯率分別為8.3%、7.7%，與已經(jīng)報(bào)道的G11778A、G3460A、T14484C這3個(gè)原發(fā)性突變位點(diǎn)的家系類似，且與T12338C、A14693G、T3394C突變的家系外顯率相近，這表明線粒體tRNATyrA5834G突變可能在LHON中發(fā)揮協(xié)同作用，是與LHON相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)，同時(shí)低外顯率提示可能存在其他因素（核修飾基因、環(huán)境等）影響這2個(gè)家系的表型表達(dá)。