閆彩霞，李春娟，孫全喜，張 浩，2，王 娟，苑翠玲，單世華*，趙小波*

(1.山東省花生研究所,山東 青島266100；2.山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,山東 泰安271018)

花生(Arachis hypogaeaL.)種植范圍廣泛,是人類食用植物蛋白質(zhì)和植物油的重要來源[1]。我國花生生產(chǎn)水平較高,以全球第二的花生種植面積提供了40%以上的產(chǎn)量[2]。但干旱嚴重影響了我國花生產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展,每年因干旱引起的減產(chǎn)達30%～50%[3]。在干旱半干旱環(huán)境下進一步提高花生產(chǎn)量是科研人員面臨的嚴峻現(xiàn)實問題。因此,培育抗旱花生品種,對于花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關重要。傳統(tǒng)育種方法由于周期較長,效率相對較低。通過分子生物學技術培育抗旱花生新品種是重要及有效的方法。

FARl(far-red impaired response1)是最初被發(fā)現(xiàn)的遠紅光受體光敏色素phy A下游的信號蛋白。作為信號通路的正調(diào)控因子,最初通過圖位克隆得到[4]。FARl家族能夠穩(wěn)定地存在于擬南芥基因組中,且無TIR序列(末端反向重復序列)[5]。該家族一個序列與轉座酶Jittery[6]和MuRA[5]相似。

FARl能特異地識別啟動子FBS順式作用元件[7],從而調(diào)節(jié)各類基因表達。目前FARl轉錄因子相關研究多集中于植物光信號調(diào)節(jié)方面,涉及非生物脅迫下花生FARl轉錄因子的研究甚為缺乏。

本研究利用生物信息學方法,分析了花生Ah J11-FAR1-5轉錄因子的理化特性及系統(tǒng)進化關系,并利用基因過表達法對提高植株抗旱能力的功能進行檢驗,為花生抗旱育種提供新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 RACE克隆與功能驗證

所用品種J11,2015年種植于仲愷農(nóng)業(yè)工程學院花山試驗基地。取當年飽滿一致的高活力花生種子進行轉錄組測序,FAR1-5轉錄因子上調(diào)表達[8-9],將其命名為Ah J11-FAR1-5?？俁NA提取采用楊晨等[10]方法略有改進。

以前期研究為基礎設計RACE引物(表1)。提取樣品根部組織RNA,采用Clontech公司的SMART RACE試劑盒,并結合巢式PCR方法進行RACE克隆。反應條件依據(jù)試劑盒說明書進行。

將測序結果進行拼接后設計全長PCR擴增產(chǎn)物,用UNIQ-10 PCR Purification Kit試劑盒純化,純化產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接后轉化至感受態(tài)大腸桿菌中,采用菌液PCR擴增預檢測是否有插入片段并測序[11],擴增引物為AhJ11-FAR1-5-S1:5'-CGCAGTGGTTTCCAATGGATTT-3'和AhJ11-FAR1-5-S2:5'-GCCACACCTGGGTTGGTGGACCCC-3',全長PCR擴增反應條件如下:①94℃5 min；②94℃1 min；57℃1 min；72℃4 min；共30 cycles；③72℃10 min。

得到全長序列后,參照王傳堂的方法(國家發(fā)明專利:根癌農(nóng)桿菌介導的花生高效轉基因方法,授權公告號:CN102199621B)進行轉基因花生植株構建。通過基因過表達的方式驗證該轉錄因子功能。野生型植株和轉基因植株均以15%PEG6000溶液模擬干旱處理5 d后,觀察表型變化并檢測POD、MAT、SOD和CAT含量[12]。

表1 RACE克隆所需引物Table 1 Primers for RACE in this study

圖1 Ah J 11-FAR 1-5基因氨基酸序列二級結構Fig.1 Secondary structureof threeAh J 11-FAR 1-5 amino acids

圖2 Ah J 11-FAR 1-5基因氨基酸序列的多肽跨膜結合區(qū)域Fig.2 Polypeptide transmembrane binding region of Ah J 11-FAR 1-5 amino acid

圖3 Ah J 11-FAR 1-5基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogeny estimated using Ah J 11-FAR 1-5 sequence

1.2 生物信息學分析

參考花生基因組序列(www.peanutbase.org)對花生Ah J11-FAR1-5轉錄因子進行生物信息學分析。利用NCBI上的ORF Finder分析獲得序列的全長,DNAMAN軟件對其氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析。由TMpred程序預測該轉錄因子編碼蛋白質(zhì)的跨膜結合區(qū)域。

通過NCBI檢索部分物種相關序列,利用MEGA6.0軟件采用NJ法進行FAR1-5轉錄因子系統(tǒng)進化分析,Bootstrap值設為1000。

2 結果與分析

2.1 克隆結果與生物信息學分析

克隆測序結果表明,Ah J11-FAR1-5開放閱讀框為2727 bp,共編碼908個氨基酸。其中精氨酸、纈氨酸、甘氨酸含量居前三位,分別為38個、29個和17個,占比分別為9.90%、9.60%和8.36%。其編碼蛋白的分子量大小36.415 k D、等電點9.30,其二級結構見圖1。預測編碼蛋白質(zhì)的跨膜結合區(qū)域,發(fā)現(xiàn)由內(nèi)到外、由外到內(nèi)的跨膜區(qū)域均為1個(圖2)。

檢索NCBI上部分物種已知相似基因的核苷酸序列,與花生AhJ11-FAR1-5轉錄因子序列利用MEGA6.0進行聚類分析(圖3),Ah J11-FAR1-5轉錄因子與Arachis duranensis等花生屬物種具有較近的親緣關系,花生屬FAR1-5類基因自成一個分支。栽培與野生花生基因組測序結果表明,栽培花生的祖先為野生花生A.duranensis與A.ipaensis,分別與栽培花生A亞基因組、B亞基因組相似度極高[13-14]。

2.2 基因功能驗證

正常條件下,野生型與轉基因花生表型無明顯差異。干旱脅迫處理5 d后,野生型花生萎蔫狀態(tài)更明顯(圖4)。正常條件下,野生型與轉基因花生MDA水平無顯著差異。干旱脅迫下,野生型花生MDA含量顯著高于轉基因植株。檢測結果顯示,轉基因花生SOD、POD和CAT含量在干旱脅迫下顯著高于野生型,轉基因植株SOD、POD、CAT含量分別為野生型植株的116%、124%和140%(圖5),表明花生Ah J11-FAR1-5基因可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)以應答干旱脅迫環(huán)境。

圖4 干旱處理轉基因與野生型花生Fig.4 Drought-treatment assay of wild type and transgenic peanut plants

圖5 不同狀態(tài)野生型花生與轉基因花生生理指標變化Fig.5 The total activities of the physiological changes in the wild type and transgenic plants under normal condition and drought stress treatment

3 討 論

目前現(xiàn)有FAR1類轉錄因子的研究主要集中于植物光形態(tài)建成領域。FAR1是phy A信號通路重要的轉錄因子,通過識別激活含有FBS順式作用元件的基因協(xié)助phy A進入細胞核[15]。

FAR1類轉錄因子在植物干旱脅迫響應中的研究較少,研究表明過表達FAR1類轉錄因子,擬南芥的抗旱能力可得到顯著增強[16]。本研究中,轉Ah J11-FAR1-5基因花生植株相對野生型植株,萎蔫程度更低,MDA含量下降,POD、SOD、CAT含量增加。其作用機制可能為該轉錄因子正調(diào)控ABA(脫落酸)信號響應,可直接激活調(diào)控ABI5(ABA insentive5)基因表達。干旱脅迫下,抗旱花生品種ABA含量顯著升高,抗氧化酶活性明顯升高,膜脂完整性好,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量高,ABA含量的提高能夠明顯幫助花生應答干旱脅迫[17]。