賈 姝 赫英姿 于庭洪 趙 翀 左玲玲 宋 策

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧鳳城 118100)

柞蠶線蟲病是柞蠶被索科線蟲(Meronithidae)寄生后引起的一種寄生性病害，遼寧省約有12萬hm2柞蠶受線蟲為害，寄生率達(dá)50～60%，給柞蠶生產(chǎn)造成巨大損失[1]。柞蠶幼蟲被線蟲寄生后，隨著線蟲的發(fā)育蠶體表現(xiàn)為攝食量異常、生長發(fā)育遲緩、營養(yǎng)物質(zhì)含量降低、中腸蛋白酶活性異常等[2]。解剖病蠶可見幼蟲肌肉層薄，脂肪體少等病理變化[3]，柞蠶脂肪體是柞蠶重要的物質(zhì)代謝器官，也是寄生線蟲的營養(yǎng)物質(zhì)和能源供應(yīng)的來源，采用透射電鏡技術(shù)，觀察線蟲侵染后柞蠶脂肪體組織的超微結(jié)構(gòu)病理變化，有助于查明寄生期間柞蠶與寄生線蟲的相互關(guān)系，為探討線蟲寄生對柞蠶幼蟲的致病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試柞蠶品種為抗大，由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所提供。將孵化的柞蠶幼蟲放到無線蟲分布的麻櫟(QuercusacutissimaCarruth.)樹上放養(yǎng)，4眠起后移至有線蟲分布的柞園內(nèi)飼養(yǎng)，隨降雨幼蟲被線蟲寄生后再移至無線蟲分布的柞園內(nèi)繼續(xù)放養(yǎng)。以被線蟲寄生的柞蠶為試驗(yàn)組，同齡期健康柞蠶為對照組。

1.2 試劑與儀器

Epon812包埋劑購自Sigma公司。包埋劑的配制：A液[Epon812環(huán)氧樹脂 6.2 mL、DDSA(十二烷基琥珀酸酐) 10 mL]；B液[Epon812環(huán)氧樹脂10 mL、MNA(甲基內(nèi)次甲基四氫鄰苯二甲酸酐) 8.9 mL]；配制比例A∶B=2∶8，DMP-30(增塑劑)加入總量的1.5%。日立H-7650透射電子顯微鏡，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心提供。

1.3 柞蠶幼蟲脂肪組織超薄電鏡切片樣品制備

取線蟲寄生第14天的柞蠶幼蟲和同齡期健康幼蟲，使用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇對蠶體消毒后在無菌培養(yǎng)皿中解剖，用無菌刀片切取脂肪體組織，用3%戊二醛固定30 min后，再將脂肪體組織切成2 mm×1 mm×1 mm小塊繼續(xù)用3%戊二醛固定4 h，PBS(pH =7.4)漂洗后，1%四氧化鋨固定2 h，PBS(pH =7.4)漂洗，乙醇梯度脫水，Epon812包埋，LKB-IV超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色2 h，干燥后于115 kV電壓下用日立H-7650透射電子顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

線蟲寄生后柞蠶幼蟲脂肪體、線粒體、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)都發(fā)生明顯變化。

2.1 脂肪體細(xì)胞變化

線蟲寄生第14天柞蠶脂肪體(圖1A)與健康對照組(圖1B)相比變化明顯。對照組脂肪體細(xì)胞近似球形，數(shù)量較多，顏色較深，其內(nèi)充滿脂類物質(zhì)。而試驗(yàn)組脂肪體細(xì)胞形狀變小、不規(guī)則，數(shù)量減少，顏色變淺，推測可能是因?yàn)槠鋬?nèi)脂類物質(zhì)被分解造成脂肪體細(xì)胞干癟收縮。

2.2 脂肪體細(xì)胞線粒體變化

線蟲寄生第14天，柞蠶脂肪體細(xì)胞線粒體(圖1C)呈長橢圓形，基質(zhì)中未見到明顯顆粒體，嵴的數(shù)量也明顯減少。對照組脂肪體細(xì)胞線粒體(圖1D)呈長條形，能明顯觀察到基質(zhì)內(nèi)有許多顆粒體，其內(nèi)嵴均勻排列。健康柞蠶幼蟲脂肪體細(xì)胞線粒體呈長條形可能是因?yàn)槭艿街倔w細(xì)胞中飽滿脂肪球的擠壓的原因。

2.3 脂肪體細(xì)胞核變化

線蟲寄生14天后，試驗(yàn)組幼蟲脂肪體細(xì)胞核有明顯的病變(圖1E)，對照組脂肪體細(xì)胞核形狀飽滿呈邊緣不規(guī)則橢圓形(圖1F)，核膜表面平整，染色質(zhì)相對集中。試驗(yàn)組柞蠶脂肪體多數(shù)細(xì)胞核解體，少數(shù)未裂解的細(xì)胞核核膜表面凹凸不平，周圍聚集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，染色質(zhì)分布也較為分散。

2.4 脂肪體細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變化

電鏡下觀察到在感染線蟲第14天，柞蠶脂肪體細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)與對照組相比發(fā)生了明顯變化，健康柞蠶幼蟲扁平囊狀的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分散排列于細(xì)胞質(zhì)中，核糖體附著在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外圍，顆粒體清晰排布(圖1H)。而試驗(yàn)組脂肪體細(xì)胞內(nèi)的粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖1G)腫脹并且排列緊密，周圍未觀察到核糖體顆粒。

3 結(jié)論與討論

脂肪體是昆蟲血淋巴中的薄葉狀組織，結(jié)構(gòu)松散，能夠與血淋巴充分接觸，保證昆蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的及時(shí)供應(yīng)[4]。脂肪體的儲(chǔ)存功能是昆蟲的生命基礎(chǔ)，糖原和甘油三酯是能量儲(chǔ)存的主要形式，糖原能夠隨時(shí)降解提供能量，甘油三酯能夠通過β-氧化反應(yīng)分解成脂肪酸提供能量。另外，昆蟲的絕大多數(shù)中間代謝反應(yīng)都在脂肪體中發(fā)生，比如糖和脂質(zhì)的代謝，蛋白合成，氨基酸和氮的代謝等[5]。脂肪體除了為昆蟲的生命代謝儲(chǔ)存營養(yǎng)物質(zhì)外，還是重要的免疫器官[6-7]，在抵御病原微生物入侵和解毒過程中起著重要作用[8-11,12]。

病原物入侵會(huì)破壞昆蟲的脂肪體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum對寄主脂肪體的影響尤為突出，這可能是由于寄主脂肪體中富含大量脂類物質(zhì)，而某些寄生蜂成蟲缺乏脂類合成能力，其成蟲階段所需脂類物質(zhì)必須由幼蟲直接從寄主中獲得并積累[13-14]。被嗜菌異小桿線蟲(Heterorhabditisbacteriophora) 感染后的暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)和大黑鰓金龜(H.oblita)2齡幼蟲脂肪體和中腸的組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為脂肪球變形，顏色變淺，脂肪體細(xì)胞和中腸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、減少，線粒體腫脹、破裂，中腸微絨毛大量脫落，核內(nèi)染色質(zhì)大量解離，核膜破裂[15]。棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)感染中華卵索線蟲(Ovomermissinensis) 后的脂肪體細(xì)胞內(nèi)的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂肪球和細(xì)胞核等細(xì)胞器在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上均有較大的病理變化[16]。昆蟲的脂肪體分布在體腔內(nèi)消化道周圍，與血淋巴充分接觸，便于物質(zhì)的交換與運(yùn)輸。線蟲寄生期間需要從宿主血腔中吸收大量的營養(yǎng)物質(zhì)，會(huì)對血淋巴成分的組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。測定柞蠶5齡幼蟲被線蟲寄生后其血淋巴營養(yǎng)代謝發(fā)現(xiàn)，線蟲寄生柞蠶幼蟲后造成蠶體血淋巴總糖、海藻糖、甘油酯、蛋白質(zhì)含量和海藻糖酶活性顯著降低，酯酶活性升高等變化[2]。通過透射電鏡觀察柞蠶脂肪體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，被線蟲寄生14天后，柞蠶脂肪球變形、顏色變淺，這可能與線蟲寄生后柞蠶血淋巴酯酶代謝活性升高，使貯藏于脂肪體中的脂類物質(zhì)分解有關(guān)。當(dāng)酯酶活性升高時(shí)，宿主體內(nèi)大分子物質(zhì)被分解成為大量小分子物質(zhì)，釋放進(jìn)入血淋巴被寄生線蟲吸收利用[17]。另外，線蟲寄生引起寄主的免疫反應(yīng)需要大量消耗寄主的能量，并將吸收的脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為滋養(yǎng)體，引起脂肪體細(xì)胞的“能量加工廠”——線粒體結(jié)構(gòu)的病理變化，嵴的數(shù)量減少、顆粒體消失等。這種病理變化，可能是線蟲同宿主間的能量競爭的結(jié)果，并且這種營養(yǎng)競爭會(huì)朝著有利于線蟲寄生的方向發(fā)展。也可能是在線蟲寄生作用下分泌出的特殊物質(zhì)，引起了柞蠶幼蟲脂肪體細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。線蟲寄生后柞蠶脂肪體細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生病變，也揭示了寄主蛋白質(zhì)、脂類和糖類的合成受到影響。寄生線蟲消耗寄主營養(yǎng)物質(zhì)、破壞柞蠶的能量供應(yīng)系統(tǒng)，影響其他組織的能量供應(yīng)，使柞蠶正常的生長發(fā)育受阻，細(xì)胞核裂解，脂肪組織解體及功能缺失加速寄主死亡。

本研究初步明確了線蟲寄生后柞蠶脂肪體組織的超微結(jié)構(gòu)病理變化，為探討線蟲對柞蠶幼蟲的致病機(jī)制提供了組織病理學(xué)證據(jù)。脂肪體組織也是昆蟲的免疫器官，脂肪體組織發(fā)生病變也間接說明免疫系統(tǒng)遭到破壞[18]，有必要繼續(xù)開展線蟲寄生對柞蠶免疫系統(tǒng)各項(xiàng)指標(biāo)的影響研究，以期從免疫學(xué)角度揭示線蟲對柞蠶的致病機(jī)制，為柞蠶的免疫機(jī)制研究提供有參考價(jià)值的信息。