向冬梅 易思宇 唐青海

摘要：為了得到較優(yōu)的卵黃抗體提取工藝，試驗改良了辛酸法、水稀釋法、氯仿法、硫酸銨沉淀法與聚乙二醇沉淀法5種提取方法。IPGT誘導表達重組豬致病性大腸桿菌（Escherichia coli）毒素STxB蛋白（rSTxB），與佐劑71VG乳化制備免疫原免疫蛋雞，利用改良的聚乙二醇沉淀法提取高免卵黃抗體，采用SDS-PAGE電泳檢測抗體純度，通過Western blot檢測卵黃抗體和血清抗體效價。結果表明，辛酸法、水稀釋法、氯仿法、硫酸銨沉淀法、聚乙二醇沉淀法提取效率分別為96.00、81.99、155.50、65.34、46.00 mg/mL，其中聚乙二醇沉淀法的提取純度最高。重組STxB蛋白分子量大小約25 kDa，血清中抗體效價最高達到64 000倍，卵黃抗體最高稀釋倍數(shù)為16 000倍。綜合評估，聚乙二醇的提取法相對較優(yōu)，且提取的卵黃抗體具有良好的免疫活性。

關鍵詞：卵黃抗體;提取工藝;聚乙二醇沉淀法;STxB蛋白;佐劑

中圖分類號：S852.4+3 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）15-0108-06

Abstract： In order to obtain a relatively good extraction process of egg yolk antibody， five methods including octanoic acid method， water dilution method， chloroform method， ammonium sulfate precipitation method and polyethylene glycol precipitation method were improved in this experiment. Expression of recombinant porcine pathogenic Escherichia coli toxin STxB（rSTxB） was induced by IPGT， and then the immunogen was prepared by emulsifying the rSTxB with the adjuvant 71VG， and the hens were immunized， IgY was extracted by modified polyethylene glycol method. The purity of the IgY antibody was detected by SDS-PAGE electrophoresis， and the immunoactivity and titers of yolk antibody and serum antibody titer were detected by Western blot. The results showed that the extraction efficiencies of octanoic acid method， water dilution method， chloroform method， ammonium sulfate precipitation method and polyethylene glycol precipitation method were 96.00，81.99，155.50，65.34，46.00 mg/mL，respectively， and the extraction purity of polyethylene glycol precipitation was the highest. The molecular weight of rSTxB protein was about 25 kDa， the antibody titer in serum was up to 64 000 times， and the highest dilution factor of yolk antibody was 16 000 times. For the comprehensive evaluation， the extraction method of polyethylene glycol precipitation was relatively superior， and the extracted yolk antibody showed good immunological activity.

Key words： egg yolk antibody; extraction process; polyethylene glycol precipitation; STxB protein; adjuvant

卵黃抗體（IgY）是雞卵黃中的一種免疫球蛋白，屬γ球蛋白，其分子結構由二硫鍵連接的2條相同的重鏈（分子質量約66 kDa）和2條相同的輕鏈（分子質量約25 kDa）組成[1]。IgY在動物促生長、疾病診斷、預防和治療中有廣泛應用。馬蕾等[2]采用腹腔注射非微囊化的膽囊收縮素（Cholecystokinin， CCK）的特異IgY能明顯地促進動物生長。張曉萍[3]用雞作生物反應器大量生產抗生長抑制素IgY可提高其生產性能。有報道稱IgY可有效識別大分子蛋白毒素，起到降低毒素毒性的作用[4]。Wang等[5]研究顯示抗致病性大腸桿菌毒素Stx1的特異性IgY可有效阻斷Stx1與Hela細胞的結合，并可保護小鼠免受毒素攻擊。王榮[6]的研究表明IgY可阻斷產腸毒素大腸桿菌（ETEC）對宿主從腸上皮細胞的粘附。Neri等[7]針對志賀毒素（Stxs）的各種毒素中和劑研究顯示口服抗Stx-2 IgY可降低ETEC O157∶H7腸道感染小鼠的死亡率。Mine等[8]報道了口服IgY可成功治療多種胃腸道感染，如牛和人輪狀病毒、牛冠狀病毒、產腸毒素大腸桿菌、沙門氏菌等。諸多報道稱IgY在檢測疾病診斷、預防和治療方面具有穩(wěn)定性好、特異性高和靈敏度高、安全無毒、無殘留、不產生抗藥性、能增強機體免疫力等優(yōu)點[9， 10]，且可作為注射劑、口服劑或飼料添加劑用于預防和治療[11]。中國農業(yè)農村部已明確發(fā)文，規(guī)定到2020年飼料中將全面禁止添加抗生素，IgY是一種較為理想的抗生素替代品。

IgY提純的關鍵在于脂質的去除。據(jù)報道IgY提取工藝主要有沉淀法、層析法、超濾法、抽提法和反復凍融法，沉淀法又分為鹽析沉淀、有機溶劑沉淀和有機聚合物沉淀，沉淀法簡單經濟但是IgY純度低;層析法純度高但是產率低且費用高;超濾法純度高但是生產成本高不適用于工業(yè)化生產;抽提法產率較高但殘留對環(huán)境有害;而凍融法回收率低[12， 13]。為此，本研究改良并比較了IgY提取的辛酸法、水稀釋法、氯仿法、硫酸銨沉淀法和聚乙二醇沉淀法，制備重組STxB蛋白作為抗原免疫蛋雞，誘導產生特異性的IgY，通過綜合評估提取效率、純度和抗體的效價與免疫活性，得到相對較優(yōu)的IgY提取工藝，為IgY工業(yè)化生產提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

聚乙二醇（PEG-6000）、硫酸銨、辛酸、考馬斯亮藍等分析純化學試劑均購自Solarbio公司;IPTG為寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司產品;MONTANIDETM ISA71VG佐劑為SEPPIC公司產品;DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋公司產品;Mouse anti-His單克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠二抗和HRP標記的羊抗雞二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司;PVDF膜為Millipore產品;表達志賀氏毒素的表達菌株BL21（DE3）-pET28a-STxB由衡陽師范學院畜禽養(yǎng)殖生物工程技術研究所構建保存。

1.2 方法

1.2.1 卵黃抗體的5種提取工藝 收集160日產蛋高峰期的商品蛋（產蛋雞按照蛋雞常規(guī)免疫程序作了相應的免疫），雞蛋洗凈后用70%的酒精擦拭消毒。分離卵黃，充分攪拌均勻，取卵黃原液分別按以下5種方法提取卵黃抗體。

1）辛酸法（Caprylic acid，CA）。根據(jù)吳博等[14]的試驗方法加以改良，具體如下。按照1∶4的體積比在1份卵黃原液中加入4份體積0.06 mol/L的乙酸緩沖液（pH 4.0），用5 mol/L的NaOH調節(jié)pH至4.5;每毫升卵黃液加入25 μL辛酸，混勻，室溫作用30 min。10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入10倍體積的PBS緩沖液（pH 7.4），用5 mol/L的NaOH調節(jié)pH至7.2～7.4，每毫升溶液中加入0.227 g硫酸銨，攪拌溶解，4 ℃放置1 h。4 ℃下10 000 r/min離心30 min，棄去上清液，沉淀物中加入濃度為14%的硫酸銨溶液。4 ℃下10 000 r/min離心30 min，去掉上清液，沉淀稱重并加入PBS（pH 7.4）溶液溶解（每10 mL卵黃原液用1 mL PBS溶液溶解），-20 ℃保存。

2）水稀釋法（Water dilution，WD）。根據(jù)Ren等[15]的試驗方法進行改進，具體如下。按照1∶9的體積比在1份卵黃液中加入9份體積的去離子水，攪拌均勻;用1 mol/L HCl調節(jié)卵黃液pH為5.0～5.2。4 ℃下10 000 r/min離心25 min，取上清液，再加入19%（W/V）的硫酸鈉，充分攪拌溶解后，室溫放置 ? ?2 h。4 ℃下10 000 r/min離心25 min，棄上清，沉淀稱重，在沉淀物中加入PBS（pH 7.4）溶解（每10 mL卵黃原液用1 mL PBS溶液溶解），-20 ℃保存。

3）氯仿法（Chloroform，CF）。根據(jù)劉瑞生等[13]的試驗方法進行改進，具體如下。按照1∶9的體積比在1份卵黃液中加入3份體積的PBS緩沖液（pH 7.5），混合均勻，加入等體積的氯仿，充分混勻。4 ℃下10 000 r/min離心30 min，抽取水相層，再加入12%（W/V）的聚乙二醇（PEG-6000），攪拌均勻，室溫下作用30 min。4 ℃下10 000 r/min離心30 min，棄上清液，沉淀稱重，在沉淀物加入PBS（pH 7.4）溶解（每10 mL卵黃原液用1 mL PBS溶液溶解）， ?-20 ℃保存。

4）硫酸銨沉淀法（Ammonium sulfate precipitation，AS）。根據(jù)蔣興龍等[16]的試驗方法進行改進，具體如下。按照1∶9的體積比在1份卵黃液中加入9份體積的去離子水稀釋，充分攪拌均勻;用0.1 mol/L HCl 調節(jié)卵黃液pH為5.0～5.2，充分攪拌均勻，4 ℃靜置過夜，至脂類分層。4 ℃下12 000 r/min離心30 min，收集上清;然后在上清液中加入硫酸銨，至終濃度為20%（W/V）， 充分攪拌溶解后，室溫靜置1 h。4 ℃下12 000 r/min離心30 min，棄掉上清，往沉淀中加入PBS（pH 7.4）溶液15 mL懸浮溶解沉淀;再加入硫酸銨，至終濃度為14%（W/V），充分攪拌溶解后，室溫下靜置1 h。4 ℃下12 000 r/min離心30 min，棄上清液，沉淀稱重，在沉淀物加入PBS（pH 7.4）溶液溶解（每10 mL卵黃原液用1 mL PBS溶液溶解），-20 ℃保存。

5）聚乙二醇沉淀法（Polyethylene glycol precipitation，PEG）。根據(jù)Pauly等[17]的試驗方法進行改進，具體如下。按照1∶2的體積比在1份卵黃液中加入2份體積的PBS緩沖液（pH 7.5），劇烈振蕩 ?30 s，再加入3.5%（W/V）的聚乙二醇（PEG-6 000）充分攪拌溶解，室溫下作用20 min。4 ℃下12 000 ? ? ?r/min離心30 min，2層濾紙過濾，在濾液中加入8.5%（W/V）的聚乙二醇（PEG-6000），充分攪拌溶解，室溫下作用20 min。4 ℃下12 000 r/min離心30 min，棄去上清液，在沉淀物中加PBS（pH 7.4）溶液溶解，加12%（W/V）的聚乙二醇（PEG-6000），室溫下作用10 min。4 ℃下12 000 r/min離心30 min，去上清，沉淀稱重，在沉淀物中加入PBS（pH 7.4）溶液溶解（每10 mL卵黃原液用1 mL PBS溶液溶解），-20 ℃保存。

1.2.2 提取效率統(tǒng)計與純度檢驗 根據(jù)提取效率=（離心管重+沉淀重）/所用卵黃液體積，統(tǒng)計各種方法的提取效率。通過SDS-PAGE電泳檢測各種方法提取的IgY純度。

1.2.3 特異性卵黃抗體的制備 采用特定抗原免疫蛋雞，制備特異性卵黃抗體，驗證以上最優(yōu)工藝提取的IgY的免疫活性，具體步驟如下。

1）抗原蛋白StxB的制備與鑒定。取表達菌株菌液[BL21（DE3）-pET28a-STxB]50 μL，接種于200 mL含有卡那霉素（終濃度為200 ng/mL）的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16～18 h;次日，往200 mL菌液中分別加入100 mL LB培養(yǎng)基后再加入卡那霉素（終濃度為200 ng/mL）和IPTG（終濃度為1 mmo/L），誘導6 h;4 ℃下10 000 r/min離心10 min，收集菌體;菌體用PBS溶液懸起后進行超聲裂解，超聲參數(shù)為超聲5 s，間隔5 s，時間為30 min，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS溶液將沉淀懸起，進行第2次超聲，超聲參數(shù)同上，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，棄上清，收集沉淀用40 mL包涵體溶解液懸起，超聲輔助溶解即為抗原蛋白StxB。取制備樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，之后采用Western blot鑒定：轉膜完成后用2%的PBS-脫脂奶封閉1 h，之后加入以1∶2 000稀釋的Anti-his mAb 37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次之后加入1∶2 000稀釋的HRP-Goat-Anti-mouse IgG 37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次之后進行DAB顯色。

2）疫苗制備與動物免疫。將表達得到的抗原蛋白StxB（3份）與疫苗佐劑MONTANIDETM ISA 71VG（7份）進行乳化，制備成免疫原StxB-71VG。將12只180日齡的海蘭褐蛋雞隨機分為2組，每組6只，試驗組胸部肌肉注射StxB-71VG，1 mL/羽，共免疫2次，間隔14 d，對照組不做免疫。

3）樣品的采集與制備。于首次免疫后第0、7、14、21、35、49天翼下靜脈采血1 mL，37 ℃放置3 h，4 ℃放置過夜，5 000 r/min離心5 min分離制備血清，血清樣品于-20 ℃保存，用于抗體滴度檢測。收集首次免疫后第0、14、21、28、35、49天的雞蛋，于 4 ℃保存，采用上述5種方法中提取效果最好的方法進行卵黃抗體的提取，用于后續(xù)抗體滴度檢測。

1.2.4 重組蛋白STxB特異性血清抗體與卵黃抗體的免疫活性與滴度檢測 采用Western blot方法檢測抗原蛋白STxB特異性血清抗體與卵黃抗體，具體步驟如下：蛋白樣品STxB通過蛋白凝膠電泳后，轉印到PVDF膜上，用2%PBS-脫脂奶封閉1 h，PBST洗3次，再將“1.2.3”中制備的血清抗體或卵黃抗體作倍比稀釋（初始濃度按1∶100稀釋），稀釋后的抗體與轉印膜于37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，HRP-羊抗雞二抗（1∶3 000） 37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，DAB顯色。以顯色為陽性的最高稀釋倍數(shù)表示血清抗體和卵黃滴度。

2 結果與分析

2.1 5種方法的提取效率與卵黃抗體純度

試驗結果表明，辛酸法（CA）、水稀釋法（WD）、氯仿法（CF）、硫酸銨沉淀法（AS）和聚乙二醇沉淀法（PEG）的提取效率依次為96.00、81.99、155.50、65.34和46.00 mg/mL。

通過SDS-PAGE電泳檢測所提取的IgY純度，由圖1可以看出，辛酸法所提IgY抗體純度很低，重鏈（約66 kDa）不明顯，輕鏈（約25 kDa）條帶缺失，且雜蛋白條帶較多（35～40 kDa）;水稀釋法所提IgY其重鏈與輕鏈抗體鏈較明顯，中間含有少量的雜帶（35～40 kDa）;氯仿法所提IgY重鏈和輕鏈抗體鏈條帶較明顯，雜蛋白條帶較多（35～55 kDa）;硫酸銨沉淀法的重鏈與輕鏈抗體鏈都比較明顯，雜蛋白條帶較多（35～55 kDa），純度較低;聚乙二醇法重鏈與輕鏈抗體鏈均很明顯，雜蛋白條帶較相對較少，其純度很高。

2.2 重組蛋白STxB的表達與鑒定

將得到的重組STxB蛋白（rSTxB）采用超聲法進行3次純化，分別在第1次、第2次、第3次超聲完成后取500 μL，對3次純化的溶液進行SDS-PAGE檢測，結果在約25 kDa處出現(xiàn)清晰條帶（圖2a），與預期相符，可以看出第3次超聲之后得到比較純凈的目的蛋白，基本沒有雜帶。重組STxB蛋白經Western blot鑒定，結果顯示，在約25 kDa處出現(xiàn)清晰的特異性印跡條帶，表明所純化的蛋白為重組STxB蛋白（圖2b）。

2.3 卵黃抗體提取效率及效價測定

用聚乙二醇法提取首次免疫后第0、14、21、28、35和49 天的雞蛋的卵黃抗體平均提取效率分別為33.10、32.70、33.90、43.30、43.70和43.80 mg/mL。對首次免疫后第0、14、21、28、35、49天的雞蛋提取IgY，經SDS-PAGE檢測純度，結果顯示重鏈和輕鏈明顯，其他雜蛋白占比很低（圖3）。

Western blot檢測提取的IgY免疫活性及其效價，結果顯示，首次免疫后第14、21、28天的雞蛋的卵黃抗體與重組蛋白反應性良好，且呈陽性的最高稀釋倍數(shù)依次為8 000、16 000和16 000倍（圖4）。

為比較卵黃抗體與血清抗體效價之間的差異及其動態(tài)關聯(lián)性，將血清樣品稀釋后進行Western blot效價測定，結果顯示，首次免疫后第0、14、21、28、35、49天的血清效價依次為0、12 800×、16 000×、 32 000×、64 000×和64 000×（圖5）。

3 小結與討論

本研究通過對辛酸法（CA）、水稀釋法（WD）、氯仿法（CF）、硫酸銨沉淀法（AS）和聚乙二醇沉淀法（PEG）5種方法進行了比較，得出聚乙二醇沉淀法提取的卵黃抗體純度最高。辛酸法的平均提取效率為96.00 mg/mL，在5種方法中提取效率較高，僅低于氯仿法，但其抗體純度卻最低，其容易和IgY以外的大部分蛋白質分子結合，形成不可逆的沉淀。水稀釋法的平均提取效率為81.99 mg/mL，提取效率較高，純度較高，只低于聚乙二醇法所提取的卵黃抗體純度，且工藝簡單、生產成本低、回收率高。氯仿法的平均提取效率為155.50 mg/mL，提取效率在5種方法中最高，但純度與水稀釋法相仿，純度不高;研究表明，氯仿可使ELISA非特異性吸附從而造成假陽性[18]。硫酸銨沉淀法的平均提取效率為65.34 mg/mL，提取效率很低，高于聚乙二醇沉淀法，但提取純度不高;聚乙二醇沉淀法的平均提取效率為46.00 mg/mL，在5種方法中純度最高;且聚乙二醇親水性強，可以在不造成蛋白質變性的情況下使IgY迅速沉淀[18]。

在試驗的5種方法中，PEG沉淀法改進之后，與Pauly等[17]的試驗方案相比，提取量多，純度更高，所用步驟更少，所以本試驗采用的聚乙二醇沉淀法（PEG法）更為簡便，用時更少，更適合于工業(yè)化的批量生產。吳博等[14]的試驗中，辛酸法提取效率較高，這有可能與辛酸的添加量有關。在本試驗中辛酸只添加了25 μL，與吳博等[14]的試驗中所添加的1%～3%的辛酸量相差較大，因此該方法或許可以加大辛酸的添加量以獲得更好的提取效果。水稀釋法的試驗結果與Ren等[15]的試驗結果基本一致。有研究發(fā)現(xiàn)聚乙二醇易與蛋白質疏水區(qū)碰撞，形成可逆性的沉淀復合物，可以與蛋白質一起沉淀出來[19]。在朱旭國等[20]的試驗中提到，隨著聚乙二醇濃度的增大，卵黃抗體提取率先增加，之后卻逐漸降低，譚佩毅等[21]的試驗中發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇濃度大于8.0%時，卵黃抗體提取率逐漸降低。索江華等[22]的研究結果顯示，3.5%的PEG濃度為最佳去脂濃度，1∶9的水稀釋法去脂高但抗體效價下降較多，硫酸酯葡聚糖濃度增加至1.8%以上時抗體效價有所下降。任平國等[23]采用水稀釋法以1∶8稀釋時，蛋白質和脂肪的含量趨于穩(wěn)定。李敏惠等[1]先用水稀釋法再用兩步硫酸鈉鹽析法，IgY的純度達到92%。任春芝[24]試驗中水稀釋法稀釋1～10倍發(fā)現(xiàn)，當將卵黃液5倍稀釋時，上清液中可溶性蛋白質含量最低，9倍稀釋時含量最高，稀釋倍數(shù)再增高含量又會降低，卵黃液的最佳稀釋倍數(shù)為9倍稀釋。陽元娥[12]試驗中提出，12%的PEG沉淀法是最為有效的沉淀方法。另外，在韓繼剛等[25]的試驗中提到，聚乙二醇的沉淀效果不僅取決于小分子蛋白的特性和濃度，還取決于溶液中鹽的濃度。在聚乙二醇沉淀法中或許可以考慮聚乙二醇與適量的中性鹽結合添加，以獲得更好的聚乙二醇沉淀效果。在本試驗中，對聚乙二醇沉淀法改良分別添加了3.5%、8.5%、12% 3次不同濃度的聚乙二醇。聚乙二醇的提取效率相對較低，與聚乙二醇的添加步驟與濃度是否有關，以及通過降低聚乙二醇濃度是否能提高聚乙二醇沉淀法的提取效率，對此方面還需要做進一步研究。本試驗所采用的聚乙二醇沉淀法在提取步驟上仍然有不足的地方，聚乙二醇在卵黃抗體中有少量的殘留，工業(yè)化生產完成后還需要再次清除殘留的聚乙二醇。在去脂方面，聚乙二醇沉淀法離心后收集的上清液微黃，去脂效果不是很好，但硫酸銨沉淀法得到的上清液十分清澈，具有很好的去脂效果，或許可以考慮在聚乙二醇沉淀法的基礎上與硫酸銨沉淀法適當?shù)亟Y合以取得良好的去脂效果。

為了研究聚乙二醇沉淀法提取IgY的免疫活性，對重組載體BL21- pET28a-STxB菌株進行大量表達、制備免疫原免疫蛋雞、采集翅靜脈血清與雞蛋，經SDS-PAGE和Western blot檢測，結果表明，純化后的STxB蛋白基本上沒有雜帶，血清和卵黃中抗體具有較好的特異性。用聚乙二醇沉淀法提取首次免疫后第14、21、28天的雞蛋的卵黃抗體比首次免疫后第0、14、21、28、35、49天的血清抗體更穩(wěn)定，這與高嶺[26]研究的豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉卵黃抗體特性一致，而王金洛等[27]的研究中卵黃抗體效價高于血清抗體效價，與本試驗結果有差異，這可能與免疫程序和收蛋的時間點不同有關。

改良后的聚乙二醇沉淀法在5種方法中是最優(yōu)良的提取方法，其成本低，步驟簡便，提取的卵黃抗體數(shù)量多，提取效率較高且質量好，擁有很高的卵黃抗體純度與很高的抗體效價。因此，對改良后的聚乙二醇沉淀法進行卵黃抗體工業(yè)化生產是可行的。

參考文獻：

[1] 李敏惠， 鄒 強， 楊淑霞， 等.雞卵黃抗體IgY的分離純化及鑒定[J].生物學雜志，2009，26（6）：80-82.

[2] 馬 蕾， 姚 剛， 楊 光， 等. 微囊化與非微囊化膽囊收縮素卵黃抗體對小鼠促生長免疫效果的比較研究[J].中國畜牧獸醫(yī)， 2013， 40（12）：216-219.

[3] 張曉萍. 膽囊收縮素卵黃抗體的生物學活性及其作用機理初探[D]. 南京：南京農業(yè)大學， 2004.

[4] 邱濤濤， 徐振林， 甘慶慶， 等. 卵黃抗體體內代謝及中和毒素研究進展[J].食品科學，2019，40（5）：303-308.

[5] WANG Q， HOU X J， CAI K， et al. Passive protection of purified yolk immunoglobulin administered against Shiga toxin 1 in mouse models[J]. Canedian journal of microbiology，2010，56（12）：1003-1010.

[6] 王 榮. 具有廣譜抗ETEC腹瀉功能雞蛋的研制[D]. 武漢：華中農業(yè)大學， 2013.

[7] NERI P， TOKORO S， KOBAYASHI R， et al. Specific egg yolk immunoglobulin as a new preventive approach for Shiga-toxin-mediated diseases[J]. PLoS ONE， 2011， 6（10）： e26526.

[8] MINE Y，KOVACS-NOLAN J. Chicken egg yolk antibodies as therapeutics in enteric infectious disease： A review[J]. Journal of medicinal food， 2002， 5（3）：159-169.

[9] 吳 瓊. 抗仔豬腹瀉卵黃抗體膏的研制及應用[D]. 遼寧大連：大連理工大學，2013.

[10] 吳義龍，費榮梅. 雞卵黃抗體IgY研究進展[J].畜牧與獸醫(yī)， 2013，45（3）：94-98.

[11] 謝燕燕. 功能性卵黃粉的制備及其對仔豬生長性能的影響[D].福州：福建農林大學，2010.

[12] 陽元娥. 抗甲型流感病毒卵黃抗體的制備、活性評價及其應用研究[D]. 廣州：廣東工業(yè)大學，2016.

[13] 劉瑞生， 張洪波， 薛掌林， 等. 雞新城疫卵黃抗體提取方法篩選研究[J]. 國外畜牧學—豬與禽， 2014， 34（6）： 57-59.

[14] 吳 博，王 爽，樊興冬，等. 不同方法提取卵黃抗體效果的比較[J]. 中國獸藥雜志，2016， 46（6）： 42-45.

[15] REN H， YANG W J， THIRUMALAI D， et al. A comparative evaluation of six principal IgY antibody extraction methods[J]. Altern Lab Anim， 2016， 44（1）：11-20.

[16] 蔣興龍， 江國永， 成國祥. 幾種從雞血漿中提取免疫球蛋白IgY方法的比較[J]. 動物源性蛋白與活性肽， 2015（1）： 64-67.

[17] PAULY D， CHACANA P A， CALZADO E G， et al. IgY technology： Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol（PEG） precipitation[J].Journal of visualized experiments，2011（51）：167-174.

[18] 馬 龍. 奶牛臨床型乳房炎病原菌的分離鑒定及其卵黃抗體的制備[D]. 蘭州：甘肅農業(yè)大學， 2009.

[19] 王輝龍， 周建武， 王中來， 等. 聚乙二醇一步沉淀提取卵黃抗體[J]. 福州大學學報（自然科學版）， 2010， 29（5）： 123-126.

[20] 朱旭國， 許甜甜， 杜 寧. 聚乙二醇共沉復溶雙水相法提純氯過氧化物酶的條件研究[J]. 上海師范大學學報（自然科學版）， 2010， 30（4）： 415-420.

[21] 譚佩毅， 黃秀錦. 免疫卵黃抗體提取工藝的優(yōu)化[J].食品與機械， 2012， 28（6）：231-235.

[22] 索江華， 張 粟. 傳染性法式囊卵黃抗體不同提取工藝的比較[J]. 鄭州牧業(yè)工程高等專科學校學報，2014， 34（2）： 22-24.

[23] 任平國， 徐啟紅. 雞卵黃抗體（IgY）的制備工藝研究[J]. 食品工業(yè)， 2011， 32（1）：71-73.

[24] 任春芝. 雞球蟲多價卵黃抗體IgY的制備及其抗球蟲效果評價[D]. 江蘇揚州：揚州大學， 2011.

[25] 韓繼剛， 康 明， 劉平芳， 等. 利用聚乙二醇（PEG8000）純化小球藻病毒 FJ-1[J]. 微生物學報， 2000， 40（5）： 556-558.

[26] 高 嶺. 豬傳染性胃腸炎病毒與豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體的制備及純化工藝研究[D]. 河北保定：河北農業(yè)大學， 2014.

[27] 王金洛，徐福洲，楊 兵，等. 仔豬腹瀉多病原特異性卵黃抗體（IgY）治療和預防劑的研究[A]. 中國畜牧獸醫(yī)學會第一屆中國養(yǎng)豬生產和疾病控制技術大會. 2005中國畜牧獸醫(yī)學會學術年會論文集[C]. 北京：中國畜牧獸醫(yī)學會，2005.805-808.