姜麗艷，閆國棟，徐 陽

（吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012）

興奮劑檢測是一項難度很高、責(zé)任十分重大的工作，給國際體育組織和各國政府及反興奮劑機(jī)構(gòu)帶來了巨額財政負(fù)擔(dān)[1]。近年來，利用分子印跡膜和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，逐漸在興奮劑檢測中嶄露頭角，具有靈敏度高、高通量檢測、可選擇性、實用性等優(yōu)點[2-3]。該技術(shù)需要將分子印跡膜紡絲在質(zhì)譜的進(jìn)樣靶板上，才能完成質(zhì)譜的檢測。靜電紡絲技術(shù)是一種利用高壓靜電來制備納米纖維的方法，最大的優(yōu)點是操作方便、成本低、可大批量生產(chǎn)，在催化劑、傳感器、組織工程、食品包裝和過濾防護(hù)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[4-5]。將靜電紡絲膜用于質(zhì)譜檢測興奮劑類藥品的研究還少有報道。目前市面上并沒有成型的紡絲膜制備儀器，所以搭建靜電紡絲膜裝置，并優(yōu)化靜電紡絲條件是將靜電紡絲膜引入質(zhì)譜檢測興奮劑類藥物的基礎(chǔ)。

1 靜電紡絲裝置搭建與運(yùn)行

1.1 靜電紡絲過程及硬件組成

靜電紡絲過程：裝有高分子溶液的注射器連接直流高壓電源；在高壓電場作用下，高分子溶液在平口針頭上形成“泰勒錐”，在“泰勒錐”的“錐尖”處，高分子溶液突破自身的表面張力，在高壓電場作用下噴出；高分子溶液噴出后，落到接收板上并在這個過程中固化[6]。

靜電紡絲模擬裝置的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1，實物圖見圖2。裝置包括：高壓電源型號為 73030P，輸入電壓為DC 24 V，輸出電壓為0～30 kV，輸入功率最大為30 W；注射泵（保定迪創(chuàng)電子科技有限公司，型號為LSP01-1B）；恒溫恒濕箱（自制）；接收器等。各零件為自買或自制，將置為自行搭建。

1.2 分子印跡聚合物的配制

圖1 靜電紡絲裝置的結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 靜電紡絲裝置的實物圖

將克倫特羅（0.4 mmol）或沙丁胺醇（0.5 mmol）和甲基丙烯酸（MAA，0.5 mmol）溶解在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，超聲后，加入二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，8 mmol），苯乙烯（1.0 mL）和 0.05 g偶氮二異丁腈（AIBN）；混合液加入100 mL 0.25%的SDS（十二烷基硫酸鈉）水溶液中，加入0.8 g 十八烷穩(wěn)定劑；乳液在冰浴的作用下，600 W 粉碎機(jī)超聲20 min，制得細(xì)乳液；將乳液倒入250 mL 三頸瓶中，在 N2除氧，400 r/min 攪拌的作用下在 60 ℃下聚合24 h，聚合物從系統(tǒng)中離心分離，用乙醇洗滌；用20%的乙酸甲醇溶液索氏提取24 h，去除分子印跡模板，再用去離子水洗凈，烘干即可[7-9]。

1.3 靜電紡絲膜的制備

將上述得到的分子印跡聚合物材料適量加到二甲基甲酰胺（DMF）中，超聲至完全溶解，再加入適當(dāng)比例的聚丙烯腈(PAN，分子量為8 萬或15 萬)，恒溫攪拌至完全均勻，采用前述的紡絲膜制備裝置進(jìn)行紡絲膜的制備[10]。

2 靜電紡絲工藝優(yōu)化

2.1 單因素優(yōu)化

分別對聚丙烯腈的分子量和用量、加熱溫度、攪拌時間、灌注量、流速、接收距離和接收器高度進(jìn)行了單因素優(yōu)化實驗。實驗發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)的紡絲膜液配制：0.12 g 克倫特羅或沙丁胺醇的印跡聚合物材料，加入20 mL 的DMF 中，超聲30 min 至完全溶解，再加入1.6 g PAN (分子量為8 萬)，60 ℃恒溫攪拌3 h。最佳的紡膜條件：電壓 15 kV，灌注量 0.05 mL，流速0.005 mL/min，紡絲膜距離15 cm，接收器高度6～7 cm。靜電紡絲膜的展示圖見圖3。

圖3 靜電紡絲膜展示圖

2.2 靜電紡絲膜的表征

圖4 分子印跡復(fù)合膜的SEM 表征

掃描電鏡的實驗結(jié)果見圖4 和圖5。從圖4 和圖5中可以觀察到，分子印跡聚合物材料已經(jīng)均勻地分布于PAN 納米纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。對分子印跡復(fù)合膜進(jìn)行了紅外光譜的掃描，實驗結(jié)果見圖6，在分子印跡復(fù)合膜的紅外光譜圖中，2214 cm-1為—C≡≡N 的伸縮振動峰，2920 cm-1為的—C—H 伸縮振動峰，1455cm-1為—CH2的彎曲振動峰。結(jié)果表明聚合物材料為PAN。1731 cm-1為—C==O 的伸縮振動峰，證明了分子印跡聚合物成功的封裝在紡絲材料中。

圖5 分子印跡復(fù)合膜的SEM 表征（放大）

圖6 分子印跡復(fù)合膜的紅外光譜圖

3 靜電紡絲裝置的實驗教學(xué)應(yīng)用

應(yīng)用搭建的靜電紡絲裝置開設(shè)了“興奮劑類藥物檢測的新方法研究”開放性創(chuàng)新實驗。開放性創(chuàng)新實驗是以問題為基礎(chǔ)的研究性實驗，屬于實踐教學(xué)體系的綜合訓(xùn)練層次?！芭d奮劑類藥物檢測的新方法研究”開放性創(chuàng)新實驗主要以3 人為小組單位的形式實施。學(xué)生根據(jù)實驗項目及指導(dǎo)教師介紹，選擇實驗項目；教師確認(rèn)后，學(xué)生自行查閱有關(guān)質(zhì)譜檢測興奮劑類藥物的文獻(xiàn)，撰寫實驗設(shè)計，制訂實驗方案；教師審批并指導(dǎo)實驗；然后再加入利用靜電紡絲膜進(jìn)行興奮劑類藥物的檢測實驗。

3.1 實驗方法

興奮劑標(biāo)準(zhǔn)品的配制：克倫特羅乙醇溶液和沙丁胺醇水溶液，終質(zhì)量濃度分別為1 g/L。實驗通常采用混合點樣法，即將CHCA（α-氰基-4 羥基肉桂酸）基質(zhì)與克倫特羅乙醇溶液或沙丁胺醇水溶液標(biāo)準(zhǔn)品按體積比 1∶1 比例混合后，直接點在空靶板上或紡絲膜上，自然干燥，以能夠在靶板上形成淡黃色雪花狀結(jié)晶薄層為宜，然后進(jìn)行飛行時間質(zhì)譜儀檢測[11-12]。

CHCA 基質(zhì)的配制方法：8 mg CHCA 基質(zhì)溶于1 mL 含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液中。

檢測條件：采用激光能量為3000～4000 μJ，激光在樣品點上隨機(jī)打擊50 個位置，每個位置上的激光打擊次數(shù)為20。采用反射正離子檢測模式，分子量設(shè)定范圍為 100～600 Da。

3.2 實驗結(jié)果

圖7 實驗結(jié)果

圖7 的實驗結(jié)果（M/Z為質(zhì)荷比）表明，與正常的檢測空靶相比，利用分子印跡復(fù)合膜檢測的興奮劑藥物克倫特羅、沙丁胺醇和福莫特羅的標(biāo)準(zhǔn)液，具有背景噪聲小、檢測信號強(qiáng)的特點，測試效果明顯強(qiáng)于空靶檢測。通過興奮劑藥物的檢測實驗，充分體現(xiàn)了靜電紡絲裝置的有效性和實用性，可廣泛推廣到實驗教學(xué)環(huán)節(jié)中。通過這些有效的、對比的實驗教學(xué)實例，使學(xué)生積累一定的感性認(rèn)識，從而提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)效率，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新精神，加強(qiáng)了學(xué)生的科學(xué)研究意識[13-15]。儀器搭建和使用技能也是對學(xué)生的一種專業(yè)素養(yǎng)培訓(xùn)，能夠提高學(xué)生的綜合專業(yè)素養(yǎng)和自主探索能力。

4 結(jié)語

本文搭建的靜電紡絲裝置設(shè)計合理，安全可靠，搭建簡單，實用高效。優(yōu)化了靜電紡絲條件，建立了穩(wěn)定可用的靜電紡絲工藝。目前，該裝置成功地應(yīng)用于MALDI-MS 檢測興奮劑類藥物的實驗教學(xué)中，取得了良好的教學(xué)效果，開拓了本科實踐教學(xué)內(nèi)容，提高了本科實踐教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)和提高了學(xué)生的實驗探索及開拓創(chuàng)新精神。通過實驗探索發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用靜電紡絲膜檢測興奮劑類藥物是一種經(jīng)濟(jì)、快速、精確的新方法，更是一種具有深遠(yuǎn)意義的新技術(shù)。