陳映彤，于錫宏,2#，白國梁，張雪，劉漢兵，趙恒田，蔣欣梅,2*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點試驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；2.林下經(jīng)濟資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱 150040；3.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150040)

遼東楤木(Araliaelata)也稱刺嫩芽、刺老芽，是五加科楤木屬植物，主要分布在我國東北部地區(qū)。遼東楤木是一種重要的藥食同源植物，食用的嫩芽中含有多種氨基酸、維生素及大量的微量元素，能夠為人體提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時具有很好的保健作用，具有活血化瘀、抗癌等功效，被譽為“山野菜之王”[1]。隨著人們對這種藥食同源類植物的需求升高，很多野生資源遭到破壞，大面積的遼東楤木資源消失，人工栽培成為解決遼東楤木資源匱乏的主要途徑。然而，很多野生資源常常因種胚發(fā)育不完全，具有很強的休眠特性[2]，遼東楤木也如此，人工栽培利用種子繁殖的過程中，解除種子休眠是首要的問題。打破種子休眠有很多種方法，包括低溫層積處理、外源激素處理、光照、超聲波及機械處理等[3]。生產(chǎn)中常常在上凍前采用低溫層積處理——即沙藏方式，第二年早春取出后進行播種育苗；采用變溫層積盡管可以有效提高遼東楤木種胚的后熟，但依然存在發(fā)芽率較低且發(fā)芽持續(xù)時間長的問題[4]。赤霉素作為一種生長素，是植物生長中最重要的物質(zhì)之一，赤霉素含量降低往往意味著植株體的休眠甚至死亡，特別是對于種子來說，赤霉素含量的高低影響著種子內(nèi)進行物質(zhì)運輸?shù)乃俣龋⑶矣绊懪叩姆只蜕L，適宜濃度的赤霉素對種子的萌發(fā)具有促進作用[5]。關(guān)于外源施用赤霉素對遼東楤木種子萌發(fā)方面的研究鮮有報道，為此，本試驗通過研究不同濃度外源赤霉素處理變溫層積后的遼東楤木種子，擬明確種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物質(zhì)的變化規(guī)律，旨在為探究遼東楤木種子萌發(fā)機理提供理論依據(jù)，同時為遼東楤木種苗生產(chǎn)選用適宜的赤霉素濃度提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本材料選用當(dāng)年飽滿成熟的遼東楤木種子，來自于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室。

1.2 試驗方法

將采集的遼東楤木種子洗凈，用水浮法去除癟粒。浸種48 h后選取籽粒飽滿種子進行變溫層積處理(沙藏層積用的細河沙經(jīng)高溫滅菌)，即將層積的遼東楤木種子放在(12±1)℃下恒溫箱中處理90 d、(4±1)℃下處理60 d。將經(jīng)變溫層積處理后的種子采用不同濃度外源赤霉素(GA3)浸種12 h后放在20 ℃條件下催芽。外源赤霉素設(shè)置5個濃度水平，分別為100、150、200、250、300 mg/kg(代碼分別為T100、T150、T200、T250、T300)，以清水作為對照(CK)。

分別在催芽后的第10 d、30 d、50 d時，對種子中關(guān)鍵內(nèi)含物質(zhì)含量進行測定，其中可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[6]、可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用 G-250 法[6]、過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[7]、過氧化氫酶(CAT)活性測定采用高錳酸鉀滴定法[7]、超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用 NBT 法[7]、內(nèi)源激素(赤霉素、脫落酸)含量測定采用高效液相色譜法(HPLc)測定[6]，同時隨機選取100粒種子測定發(fā)芽率。3次重復(fù)。

采用Excel 2010和SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行計算和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子發(fā)芽率的影響

利用赤霉素處理變溫層積處理后的遼東楤木種子可以顯著提高其發(fā)芽率，赤霉素一定濃度范圍內(nèi)，發(fā)芽率隨著濃度的增加而增加。催芽后10 d開始陸續(xù)發(fā)芽；催芽后30 d開始，不同濃度赤霉素處理的遼東楤木種子發(fā)芽率顯著提高，其中催芽后30 d時的發(fā)芽率盡管在25.67 %～27.99%，但赤霉素濃度在200～300 mg/kg的3個處理(T200、T250、T300)與T150之間均差異不顯著，但顯著高于T100處理；隨著催芽時間延長，在催芽后50 d時各個處理發(fā)芽率均達到了50%以上，此時發(fā)芽率隨著赤霉素濃度的增加而顯著增加，濃度達到200 mg/kg時(T200)發(fā)芽率最高，達到了66.22%，比對照CK提高了 18.74 %，而后再隨赤霉素濃度增加而發(fā)芽率顯著降低。

圖1 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子發(fā)芽率的影響不同字母表示P<0.05水平(n=3)差異顯著。下同。

2.2 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由表1可知，隨著遼東楤木種子的萌發(fā)，可溶性糖含量逐漸降低而可溶性蛋白含量逐漸增加?？扇苄蕴呛吭诖哐亢笄?0 d變化不明顯，進入50 d時，隨赤霉素濃度的增加，可溶性糖含量表現(xiàn)出先下降再上升趨勢; 可溶性蛋白質(zhì)含量在催芽后前10 d各個處理與對照之間均差異不顯著，催芽后30 d和50 d時，均隨赤霉素濃度的增加表現(xiàn)出先升高后下降趨勢；其中200 mg/kg赤霉素處理(T200)下的可溶性糖含量在催芽后50 d最低，與其他處理及對照之間差異顯著；T200處理下的可溶性蛋白質(zhì)含量在催芽后30 d和50 d均最高，且與其他處理及對照之間差異顯著。

表1 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

2.3 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中相關(guān)酶活性的影響

由圖2、3、4可知，隨著處理時間的增加，遼東楤木種子逐漸萌發(fā)過程中，過氧化物酶活性(POD)、過氧化氫酶活性(CAT)和超氧化物歧化酶活性(SOD)均逐漸升高。對于POD和SOD酶活性，赤霉素處理對遼東楤木催芽前30 d影響不大，均表現(xiàn)為各個處理以及對照之間均差異不顯著，催芽后50 d時兩種酶活性隨著赤霉素濃度的增加表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，其中T200處理處于高水平；對于CAT酶活性，赤霉素處理對遼東楤木催芽前10 d影響不大，催芽后30 d和50 d，隨著赤霉素濃度的增加均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，其中T200處理處于較高水平。

圖2 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中過氧化物酶活性的影響

圖3 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中超氧化物歧化酶活性的影響

圖4 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中過氧化氫酶活性的影響

2.4 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量的影響

由表2可知，隨著遼東楤木種子的萌發(fā)，赤霉素含量逐漸升高，而脫落酸含量逐漸降低。赤霉素含量在催芽后10 d變化不明顯，催芽后30 d和50 d時，隨著外源赤霉素濃度的增加，均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；脫落酸含量在催芽后前10 d和30 d各處理及對照間均差異不顯著，在催芽后50 d時，隨著赤霉素濃度升高，脫落酸含量表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢；其中T200處理下赤霉素含量在催芽后30 d和50 d均最高，而脫落酸含量在催芽后50 d則最低，與對照之間均達到了顯著水平。

表2 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中赤霉素含量和脫落酸含量的影響

2.5 遼東楤木種子發(fā)芽率與內(nèi)含物變化相關(guān)性分析

表3 遼東楤木種子萌發(fā)率與內(nèi)含物變化相關(guān)性分析

對遼東楤木種子發(fā)芽率與內(nèi)含物含量之間進行相關(guān)性分析表明(見表3)：遼東楤木種子發(fā)芽率與可溶性糖、脫落酸呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，與可溶性蛋白質(zhì)含量、赤霉素含量以及3種酶活性(過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系?？扇苄蕴桥c可溶性蛋白質(zhì)、赤霉素、3種酶活性均呈極顯著負相關(guān)性，與脫落酸呈顯著正相關(guān)關(guān)系?？扇苄缘鞍踪|(zhì)與3種酶活性及赤霉素呈極顯著正相關(guān)，而與脫落酸呈極顯著負相關(guān)。3種酶之間以及3種酶與赤霉素之間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

種子休眠的類型多且復(fù)雜，大致為2種情況，一種是種子已經(jīng)成熟，但由于外界條件不適宜而不得不暫停萌發(fā)；另一種是種子的生理后熟和形態(tài)后熟未完成發(fā)育或受內(nèi)源激素物質(zhì)抑制而無法萌發(fā)[8]。遼東楤木種子萌發(fā)困難往往是由于其種胚發(fā)育不完全引起的休眠造成的。本試驗采用12 ℃下90 d結(jié)合4 ℃下60 d的變溫層積處理促進遼東楤木種胚后熟，經(jīng)顯微觀察層積后遼東楤木的種胚占有率達到46%，但從發(fā)芽持續(xù)時間來看，在催芽后50 d時經(jīng)過赤霉素處理的種子最高發(fā)芽率的僅為66%，說明盡管選用的種子為經(jīng)過水浮法選出的籽粒飽滿的種子，但種子個體之間種胚發(fā)育的程度不同，雖然經(jīng)過了150 d的層積處理，但依然會存在種胚尚未完全成熟的種子，采用一定濃度外源赤霉素浸種對種胚的發(fā)育有促進作用，由于赤霉素的有效性一般在2周左右[9]，本試驗中只在層積結(jié)束后對遼東楤木種子處理了1次赤霉素，這也是種子發(fā)芽時間周期長的原因之一。關(guān)于遼東楤木種子形態(tài)自然成熟過程中種胚發(fā)育情況以及赤霉素處理遼東楤木種子的使用次數(shù)還有待于進一步研究。

植物種子解除休眠的過程，是一系列內(nèi)源激素參與調(diào)控的過程，赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)是2種聯(lián)系緊密又極受關(guān)注的一對拮抗機制激素。其中赤霉素作為促進激素，在解除種子休眠方面有顯著的作用，主要表現(xiàn)為軟化種胚周圍組織，促進種胚生長；同時赤霉素能夠提高各類酶活性、促進種子內(nèi)物質(zhì)的分解與合成[10]。一定濃度的赤霉素能夠有效的克服種子休眠，使種子迅速萌發(fā)[11]。赤霉素處理在不同程度上提高了天女木蘭種子和節(jié)節(jié)麥種子的發(fā)芽率，在天女木蘭種子萌發(fā)過程中，內(nèi)源赤霉素含量不斷積累，呈現(xiàn)上升的趨勢；節(jié)節(jié)麥種子內(nèi)源赤霉素含量明顯增高[12-13]。種子休眠及解除與脫落酸水平的降低密切[14]，隨種子的萌發(fā)，脫落酸含量可自我調(diào)節(jié)而明顯下降[15]。赤霉素和脫落酸在種子內(nèi)的平衡決定了之后種子是休眠還是萌發(fā)。本試驗表明，種子萌發(fā)過程中赤霉素增加而脫落酸減少，更有利于遼東楤木種子的萌發(fā)，其中。200 mg/kg的外源赤霉素浸種效果最佳，能夠顯著提高發(fā)芽率。種子后熟過程中，種皮透性會增強，種子中抑制劑含量降低，使種子逐步達到可萌發(fā)條件。當(dāng)種子打破休眠，首先會分解種胚中大量貯藏的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)，為胚的伸長和新陳代謝提供更多的能量[16]。GA3處理種子后, 可使活力毛竹可溶性蛋白質(zhì)含量升高[17]，使華重樓種子可溶性蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢[18]，可使杜鵑花瓣中可溶性糖含量顯著提高[19]。本試驗中，遼東楤木種子經(jīng)200 mg/kg濃度的赤霉素處理后，可溶性糖含量逐漸下降而可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸上升，說明一定濃度的赤霉素能夠促進遼東楤木種子可溶性糖的水解和可溶性蛋白質(zhì)的合成。種子萌發(fā)過程中可溶性糖的降低，可能是在外源赤霉素的作用下，利用糖代謝循環(huán)的速度加快，呼吸消耗的可溶性蛋白質(zhì)高于淀粉水解的速度。大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)為代謝酶類，種子萌發(fā)過程中，酶類含量的變化在一定程度上能夠說明種子代謝活性的強弱。因此可溶性蛋白質(zhì)逐漸升高，可能是由于種子萌發(fā)的相關(guān)代謝酶的積累?？梢?，200 mg/kg赤霉素處理能夠促進遼東楤木種子可溶性糖的水解和可溶性蛋白質(zhì)的合成。

過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)是種子內(nèi)部抗氧化保護系統(tǒng)的重要保護酶，相互之間共同作用來保護種子內(nèi)部細胞[20]。CAT具有防止過氧化的功能，廣泛的存在于生物體中。POD、SOD是植物體內(nèi)具有生理活性的重要的活性氧自由基清除酶，其中POD能夠水解細胞代謝過程中產(chǎn)生的H2O2，從而保護細胞組織[21]，與植物的呼吸作用、木質(zhì)素的合成以及生長素的氧化等都有著密切的聯(lián)系。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的主要物質(zhì)，能夠防止自由基損害細胞并修復(fù)受損細胞[22]；SOD可以催化超氧自由基歧化反應(yīng)生成H2O2,產(chǎn)生的H2O2再由CAT和POD清除[23]。本試驗中，層積后的遼東楤木種子在200mg/kg外源赤霉素處理后3種酶活性逐漸升高，且在50d時過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的酶活性均達到最高值，可見，赤霉素處理遼東楤木種子后可提高POD、CAT及SOD活性，減少了自由基對萌發(fā)過程中種子細胞的損傷，進而促進了遼東楤木種子的萌發(fā)。這也與前人在露蕊烏頭種子、福建青岡種子及絲瓜種子的研究結(jié)果相一致[24-26]?？傊?，一定濃度外源赤霉素處理遼東楤木種子，對打破種子休眠、提高種子發(fā)芽率有促進作用。其中，以200mg/kg浸種效果最好。高水平的酶活性(POD、CAT、SOD)、可溶性蛋白質(zhì)含量、赤霉素含量以及低水平的可溶性糖含量、脫落酸含量有利于遼東楤木種子的萌發(fā)。