孫鳳平，李寧寧，韓雪*

(1.鄭州大學附屬兒童醫(yī)院,河南省兒童醫(yī)院,鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450053；2.河南醫(yī)學高等?？茖W校，河南 鄭州 451191)

矮小癥是影響小兒生長發(fā)育的重要問題，不僅影響ISS患兒的生活質(zhì)量和心理健康，甚至對其家庭和社會都會造成一定的負面影響[1-2]。統(tǒng)計顯示，我國兒童矮小癥發(fā)病率約為3.0%，全國4～5歲可治療的矮小患兒總?cè)藬?shù)約為700萬人。特發(fā)性矮小(idiopathic short stature，ISS) 是兒童矮小癥最常見病因，約占矮小癥的60%～80%[3-4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)驗方補中助長顆粒不僅可改善ISS患兒脾胃虛弱癥狀，還能促進患兒生長，提高血清IGF-1水平，但患兒血清生長激素(GH)水平并未明顯改變，提示該藥促生長機制不同于傳統(tǒng)的GHRH/GH/IGF-1軸[5-6]。因此，本研究通過觀察補中助長顆粒對15日齡SD大鼠血清GH/IGF-1及OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)的影響，探討其治療ISS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

15日齡雄性無特定病原體(SPF)級SD大鼠50只,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK(魯)20140007。

1.2 實驗藥品

補中助長顆粒：由人參10 g，白術(shù)10 g，山楂10 g，神曲10 g，木香10 g，陳皮10 g，當歸10 g，香附10 g，郁金5 g，酒大黃5 g，炙甘草5g組成(由河南中醫(yī)藥大學加工成膏劑，每1 g含原生藥材10 g，批號：170816；賴氨肌醇維生素B12口服液(湖南方盛制藥股份有限公司，國藥準字H43022116)。

1.3 試劑及試劑盒

Anti-OPG抗體(abcam公司，貨號：ab124820)，RANKL抗體(武漢三鷹公司，貨號：23408-1-AP)，RANK多克隆抗體(蘇州睿贏公司，貨號：RLT5881),GH試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E07342r)，IGF-1試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E04582r)，OPG試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E07404r)，RANK試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-EL023968RA)，RANKL試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E05126r)

1.4 主要儀器

徠卡手動切片機(德國徠卡公司，型號：徠卡RM2235)，奧林巴斯顯微鏡(奧林巴斯公司，型號：CX31)，酶標儀(美國熱電公司，型號：Multiskan FC)，低溫離心機(美國Thermo公司，型號：Sorvall Legend Micro 17R)。

1.5 方法

1.5.1 分組及給藥方法

15日齡SD小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，采用隨機數(shù)字法分為正常組、西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組各10只。各組動物喂飼普通飼料的同時，正常組按1 mL/(kg·d)灌服無菌水，西藥組按照1 mL/(kg·d)灌服賴氨肌醇維生素B12口服液，中藥高劑量組按4 g/(kg·d)(相當于成人等效劑量的4倍，成人按60 kg計)灌服補中助長顆粒(混懸液)，中藥中劑量組按2 g/(kg·d)(相當于成人等效劑量的2倍，成人按60 kg計)灌服補中助長顆粒(混懸液)，中藥低劑量組按1 g/(kg·d)(相當于成人等效劑量，成人按60 kg計)灌服補中助長顆粒(混懸液)，連續(xù)8周。

1.5.2 取材

灌胃8周后處死動物，處死前12 h禁食不禁水，按2 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射8%異戊巴比妥鈉麻醉，摘眼球取血，裝入采血管中，3 000 r/min離心10 min分離血清，-20℃ 保存；取部分肋軟骨，以10%福爾馬林固定后，石蠟包埋切片，以備免疫組化檢測。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 觀察指標

血清GH、IGF-1、OPG、RANK、RANKL(酶聯(lián)免疫吸附法)，肋軟骨OPG、RANK、RANKL積分光密度值(免疫組織化學染色法)。

1.6.2 血清GH、IGF-1、OPG、RANK、RANKL檢測

第一次孵育：血清GH、IGF-1、OPG、RANK、RANKL樣本各40 μL分別與生物素化單克隆特異性抗體形成夾心化合物；第二次孵育：在加入包被鏈霉親和素的磁珠微粒后，將以上復合物通過生物素和鏈霉親和素的交互作用結(jié)合到微粒上。然后將反應(yīng)液吸入測量池中，通過電磁作用將磁珠吸附在電極表面，未與磁珠結(jié)合的物質(zhì)通過ProCell/proCellM被去除。再給電極加入一定的電壓，使復合體化學發(fā)光，并通過光電倍增器測量發(fā)光強度。通過由2點校準生成的分析儀專有的校準曲線和通過試劑條碼提供的主曲線來確定結(jié)果。

1.6.3 免疫組織化學染色法檢測肋軟骨OPG、RANK、RANKL表達

將石蠟切片脫蠟入水，抗原修復，雙氧水封閉，加入抗體，用DBA顯色劑進行顯色反應(yīng)，HE復染，脫水透明。將染色后的切片置于顯微鏡高倍鏡(×400)下選取3個視野拍片，應(yīng)用XSP病理圖像分析系統(tǒng)分析圖像，以免疫組化染色陽性信號累積光密度值作為組織表達目標抗體的定量標準。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況分析

用藥過程中西藥組、中藥中劑量組各死亡1只，中藥高劑量組、中藥中劑量組各死亡2只，考慮灌胃操作不當所致。其余大鼠狀態(tài)良好，毛色光澤，動作靈活，飲食、排便、體重增長正常。

2.2 各組大鼠血清GH、IGF-1水平比較

各組大鼠血清GH水平無顯著性差異(P>0.05)，中藥中劑量組血清IGF-1水平高于其他各組，和其他組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，正常組、西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組IGF-1水平比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠GH、IGF-1水平比較

2.3 各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比較

西藥組血清OPG水平顯著高于正常組、中藥低劑量組(P<0.05)，和中藥中劑量組、中藥高劑量組血清OPG水平比較無顯著性差異(P>0.05)，中藥中劑量組血清OPG水平明顯高于正常組、中藥高劑量組、中藥低劑量組(P<0.05或P<0.01)，正常組、中藥高劑量組、中藥低劑量組血清OPG水平比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組大鼠血清RANK水平比較無顯著性差異(P>0.05)。中藥中劑量組血清RANKL水平顯著高于其他各組(P<0.05)，正常組、西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組血清RANKL水平無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比較

2.4 各組大鼠肋軟骨OPG、RANK、RANKL積分光密度值比較

中藥中劑量組肋軟骨OPG積分光密度值顯著高于正常組、中藥高劑量組、中藥低劑量組(P<0.05)，正常組、西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組肋軟骨OPG積分光密度值無顯著性差異(P>0.05)，各組大鼠肋軟骨RANK、RANKL積分光密度值比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠肋軟骨OPG、RANK、RANKL積分光密度值較

3 討論

ISS的發(fā)病機制目前尚不明確，相關(guān)研究主要集中在遺傳因素、GHRH/GH/IFG-1軸基因突變[7-10]、營養(yǎng)缺乏[11-12]等方面。重組人生長激素(rhGH)是治療ISS的首選藥物，但該藥價格高昂，臨床療效個體差異性較大，加之其副作用所帶來的醫(yī)療風險[13-14]，在臨床上尚未達成一致。和rhGH相比，中藥具有價格低廉、使用靈活、無毒副作用等優(yōu)點，因此，中醫(yī)藥干預ISS當有很好的前景。

本研究所用經(jīng)驗方補中助長顆粒，由《小兒藥證直訣》異功散、《醫(yī)宗金鑒》顛倒木金散合香附、雞內(nèi)金、神曲、山楂等組成，具有健脾益氣、消食和胃之功，全方補脾而不壅滯，和胃而不耗氣，味溫而不助熱，且無毒副作用，適合ISS患兒長期服用[5]。課題組前期研究表明，補中助長顆?？稍黾覫SS患兒身高增長速度和預測成年身高，提高患兒血清IGF-1水平，但治療前后ISS患兒體內(nèi)GH水平無明顯變化[5-6]，提示中藥干預ISS生長不是通過傳統(tǒng)的GH/IGFs通路，而通過干預IGF-1和軟骨細胞增殖、分化和成骨可能是其促進生長的重要機制。

OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)屬于腫瘤壞死因子超家族成員，是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的骨組織代謝信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對生長板軟骨細胞的增殖、分化和成骨起著重要的作用。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)屬可溶性的分泌型糖蛋白，廣泛存在于人體骨骼、心、肺、肝等多種組織中，氨基酸全長為401個殘基，包含21個氨基酸的信號肽和380個氨基酸成熟肽[15]。NF-ΚB 受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)也屬于TNF受體家族成員，屬I型跨膜蛋白，是RANKL的信號受體。人的RANK蛋白是由616個氨基酸的組成的同源三聚體，其胞外結(jié)構(gòu)由208個氨基酸組成，包含4個富含半胱氨酸的重復序列，為N-末端，主要功能是與細胞核因子κB受體活化因子配體(receptoractivator of NF-κB ligand，RANKL)的C-端結(jié)合并產(chǎn)生傳遞信號[16]。RANKL是由371個氨基酸組成的一種Ⅱ型跨膜蛋白，在成骨細胞、軟骨細胞和骨髓干細胞及T、B淋巴細胞均有廣泛地表達[17]。OPG主要通過與RANK競爭性結(jié)合RANKL，阻礙RANKL與RANK的結(jié)合，從而拮抗RANK所介導的生物學效應(yīng)，降低破骨細胞分化，增加BMD[18]。有人報道通過調(diào)整RANKLmRNA和OPGmRNA的表達比例，可使軟骨細胞量上調(diào)，下調(diào)RANKLmRNA可抑制破骨細胞的成熟、活化及骨吸收活性[19]。目前ISS患兒GH/IGF-1和OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)的相關(guān)性研究較少，且尚無定論。研究表明，rhIGF-1可能通過影響OPG、RANKL而調(diào)節(jié)成骨細胞、破骨細胞的平衡，促進骨重建，從而促進大鼠成骨細胞的增殖、分化[20]。也有人將SD大鼠行坐骨神經(jīng)切除術(shù)后將其分為實驗組和對照組，實驗組大鼠注射IGF-1，對照組注射生理鹽，發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠BMD增強，OPG水平增高，RANKL水平下降[21]。

本研究中，各組大鼠血清GH水平無顯著性差異(P>0.05)，中藥中劑量組血清IGF-1水平顯著高于其他各組(P<0.05)，這和課題組前期臨床研究一致[5-6]。中藥中劑量組血清OPG水平及肋軟骨OPG積分光密度值明顯高于正常組、中藥高劑量組、中藥低劑量組(P<0.05或P<0.01)，提示促進機體OPG表達是補中助長顆粒促進身高增長的重要機制。至于補中助長顆粒是通過刺激機體IGF-1表達以介導OPG表達，還是直接促進OPG表達，或二者兼而有之，有待于進一步研究。中藥中劑量組RANKL水平明顯高于其他各組(P<0.05)，這和以往報道不一致[20-21]，加之各組大鼠肋軟骨RANKL積分光密度值比較無顯著性差異(P>0.05)，由此推測，由于OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當外界因素刺激導致機體OPG表達增強的同時，RANKL表達可能也會相應(yīng)增強。在用藥過程中，各組大鼠血清及肋軟骨RANK水平無明顯變化，提示中藥補中助長顆粒在促進OPG表達的同時，抑制了RANK的表達。

綜上，本研究結(jié)果表明補中助長顆粒促進IGF、OPG的表達是其促進身高增長的重要機制。課題組將進一步觀察補中助長顆粒作用下軟骨細胞的形態(tài)學變化及其與OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)的相關(guān)性。