付金榮，朱姍，徐英，沈宇鳳，溫歡歡，吳詩瑋

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院婦科，上海 200032； 2.開封市第二中醫(yī)院，河南 開封 475004)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)是婦科常見疾病，超過10%的育齡婦女出現(xiàn)慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕，嚴(yán)重影響婦女的健康和生活質(zhì)量，且內(nèi)異癥疼痛形態(tài)多樣，反復(fù)發(fā)作，成為婦科臨床的難治之癥。筆者認(rèn)為EMs病因可歸結(jié)為“濕”“熱”“瘀”并存，互為因果，日久纏綿發(fā)為慢性盆腔疼痛，采用清熱利濕、活血止痛的盆痛靈方治療，取得滿意療效[1]，本課題通過建立SD大鼠EMs模型，采用盆痛靈直腸給藥觀察大鼠疼痛行為學(xué)的變化及其可能的作用機理，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 動物

SPF級9周齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量為(180±20)g，合格證號：SCXK(滬)2014-0016。動物購自北京維通利華實驗動物有限公司，均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)室溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，光照時間12 h，可自由飲食。動物實驗嚴(yán)格遵守上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的要求。

1.2 藥物

(1)盆痛靈水煎劑：由三棱、莪術(shù)、延胡索、川楝子和虎杖組成，水煎劑由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供，臨用前稀釋，按照成人每日用藥的20倍擴大，即按20.4 g/(kg·d)配成水煎劑，該劑量即為臨床等效量。低、中、高劑量組給藥劑量分別為10.2 g/(kg·d)、20.4 g/(kg·d)、40.8 g/(kg·d)；(2)消炎痛混懸液(規(guī)格：0.1 g，湖北東信藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H42021462)成人每日用量25 mg，臨用前按3 mg/(kg·d)配制成混懸液。

1.3 實驗主要試劑和儀器

異氟烷(湖北一品制藥股份有限公司)；TNF alpha試劑盒(批號：BMS622、BMS622TWO、BMS622TEN；廠家：Thermo Fisher)；Rat beta-NGF試劑盒(批號：ELR-bNGF；廠家：RayBiotech)；IL-1β試劑盒(批號：BMS630；廠家：Thermo Fisher)。Von Frey 2390 型機械性測痛儀(意大利UGO BASILE公司)；YP-100型嬰兒培養(yǎng)箱(日本ALOKA公司)；酶標(biāo)儀(型號：MK3；廠家：THERMO)；恒溫孵育箱(型號：DNP9082；廠家：精宏)；離心機(型號：L-500；廠家：湘儀)；微量震蕩器(型號：MM-1；廠家：金壇市醫(yī)療器械廠)。

2 實驗方法

2.1 造模、分組、給藥方法

參照Berkley[2]方法行大鼠自身種植內(nèi)膜,造模成功異位內(nèi)膜有積液形成突起，觀察病灶的大小、形態(tài)。假手術(shù)組大鼠不行內(nèi)膜種植，而是在開腹后將右側(cè)子宮結(jié)扎，將結(jié)扎段子宮剪掉，后關(guān)腹。兩周后與造模組一起常規(guī)開腹和關(guān)腹。

采用完全隨機設(shè)計方法，將60只SD雌性大鼠隨機抽取10只作為假手術(shù)組，其余作為EMs動物模型，分組及給藥方法如下：(1)假手術(shù)組，每日以2 mL 0.9%NaCl溶液灌腸；(2)模型組，每日以2 mL 0.9%NaCl溶液灌腸；(3)盆痛靈高劑量組，每日以40.8 g/kg灌腸；(4)盆痛靈中劑量組，每日以20.4 g/kg劑量灌腸；(5)盆痛靈低劑量組，每日以10.2 g/kg劑量灌腸；(6)消炎痛組，每日3 mg/kg消炎痛混懸液灌腸。

2.2 檢測方法

2.2.1 內(nèi)異灶體積的測量

測量異位灶的最大橫徑，和與之垂直的縱徑，測量器械為游標(biāo)卡尺。

2.2.2 機械痛閾的測量

保持環(huán)境的安靜,后將大鼠放置于自制的透明塑料箱里,大鼠適應(yīng)環(huán)境30 min,待其安靜后開始進(jìn)行測定。采用vonFrey2390型機械性電子測痛儀進(jìn)行測量,探針沿鐵絲網(wǎng)邊緣逐漸刺向大鼠后爪腳掌正中,后勻速施加壓力，當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮腿或逃跑行為時記錄儀器屏幕上顯示的壓力值(精確度0.1 g),此壓力值即為機械痛閾值(PWT)。

2.2.3 Elisa實驗方法

給藥4周后，將大鼠麻醉后腹主動脈取血約5 mL，離心后取上清放入-80 ℃冰箱保存待測，生理鹽水沖洗腹腔，并吸取腹腔液約2 mL同放入-80 ℃冰箱保存待測。在標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔加樣50 μL，Blank加100 μL樣本稀釋液，每孔加人生物素標(biāo)記抗體50 μL，覆上板貼，室溫孵育2 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，甩干后每孔加入100 μL酶聯(lián)親和素,覆上板貼，室溫溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，甩干后依序每孔加底物溶液100 μL，室溫避光顯色10 min。后依序每孔加終止溶液100 μL，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

2.3 檢測指標(biāo)

給藥4周，觀察：(1)機械痛閾值：采用von Frey 2390型機械性電子測痛儀進(jìn)行測量機械痛閾值(PWT)，每只大鼠重復(fù)測定3次,每次測量間隔均等，然后取平均值[3]。(2)內(nèi)異病灶體積：計算公式V=1/2a×b2(a為最大橫徑，b為與之垂直的縱徑)。(3)各組大鼠腹腔液及血清中NGF、IL-1β和TNF-α的濃度。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與管理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS21.0，計量資料如果滿足正態(tài)性和方差齊性，采用重復(fù)測量方差分析、單因素方差分析，若符合正態(tài)但不符合方差齊，用校正的配對t檢驗；若不滿足正態(tài)性采用秩和檢驗。所有檢驗均采用雙側(cè)檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 模型組大鼠手術(shù)前后機械痛閾值的變化

術(shù)前，模型組與假手術(shù)組大鼠機械痛閾值比較無明顯差異(P=0.801>0.05)。假手術(shù)組大鼠術(shù)前與術(shù)后機械痛閾值比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.647>0.05)，即手術(shù)操作對SD大鼠的機械痛閾值并無影響。模型組大鼠術(shù)后機械痛閾值呈下降趨勢，且與時間成負(fù)相關(guān)，時間越長，大鼠機械痛閾值越低，可能與內(nèi)異灶的形成有關(guān)，也進(jìn)一步說明造模是成功的。(見圖1)。

圖1 假手術(shù)組及模型組大鼠機械痛閾值的比較

3.2 內(nèi)異灶體積的大小與機械痛閾值的相關(guān)性分析

與給藥前相比，盆痛靈高、中、低劑量各組大鼠內(nèi)異灶體積均有所縮小(P<0.05)，其中以盆痛靈高、中劑量組內(nèi)異灶體積縮小明顯(P<0.05)。低劑量組與西藥組大鼠內(nèi)異灶體積給藥前后均無明顯差異(P>0.05)，模型組不予藥物治療，內(nèi)異灶體積反而增大(P<0.05)，因此模型組大鼠機械痛閾值隨著時間延長呈明顯下降趨勢，即大鼠機械痛閾值與內(nèi)異癥體積呈負(fù)相關(guān)，體積越大，痛閾值越低(見表1，圖2)。

表1 給藥前后各組大鼠內(nèi)異灶體積大小的比較

圖2 給藥前后大鼠內(nèi)異病灶體積(mm3)的變化

3.3 中藥盆痛靈對EMS模型大鼠機械痛閾值的干預(yù)作用

給藥前，即手術(shù)后1周，各組大鼠機械痛閾值比較無明顯差異(P=0.347>0.05)，給藥4周后，假手術(shù)組和模型組痛閾值無明顯差異(P>0.05)。盆痛靈高、中、低劑量組、西藥組痛閾值較給藥前均有升高(P<0.05)，盆痛靈高劑量組機械痛閾值升高最為明顯，其次為盆痛靈中劑量組，盆痛靈低劑量組的痛閾值與西藥組無顯著差異(P>0.05)，但明顯高于假手術(shù)組和模型組(見表2，圖3)。

表2 各組給藥前后大鼠痛閾值的比較

圖3 各組給藥4周大鼠機械痛閾值比較

3.4 各組大鼠腹腔液及血清中NGF、IL-1β和TNF-α的濃度影響

在血清和腹腔液中，與假手術(shù)組比較，模型組的NGF、IL-1β和TNF-α濃度均升高(P<0.01),提示IL-1β、NGF和TNF-α可能參與EMs的發(fā)病過程。與模型組比較，西藥和盆痛靈高、中劑量組血清及腹腔液中IL-1β、NGF和TNF-α水平均降低(P<0.01)，盆痛靈低劑量組血清中IL-1β降低(P<0.05)。提示西藥和盆痛靈方可能通過降低IL-1β、NGF和TNF-α濃度起到抗EMs的作用。盆痛靈各劑量組比較結(jié)果顯示，與低劑量組比較，中劑量組血清中的IL-1β、NGF表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，高劑量組血清IL-1β、NGF和TNF-α濃度降低(P<0.01)，高中劑量組腹腔液中IL-1β、NGF和TNF-α濃度均降低(P<0.01)。與中劑量組比較，高劑量組血清中NGF和TNF-α表達(dá)降低(P<0.05)，高劑量組腹腔液中IL-1β和NGF表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)(見表3，表4)。

表3 各組大鼠血清中NGF、IL-1β和TNF-α表達(dá)

表4 各組大鼠腹腔液中NGF、IL-1β和TNF-α表達(dá)

4 討論

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是一種雌激素依賴性的炎性疾病，病因復(fù)雜，病程反復(fù)，其發(fā)病率約占育齡婦女的10%，痛經(jīng)及非周期性骨盆疼痛等疼痛癥狀最為常見[4]。痛經(jīng)漸進(jìn)性加重對患病婦女的身心健康和生活質(zhì)量有著嚴(yán)重影響[5]。

盆痛靈灌腸方由三棱、莪術(shù)、虎杖、延胡索和川楝子組成，功效活血化瘀，清熱利濕。方中三棱、莪術(shù)為君，兩者均能破血祛瘀，行氣止痛。虎杖善降泄肝膽濕熱，為清熱利濕之良藥，又可活血祛瘀，逐散濕熱、瘀血之邪，方中再佐以延胡索、川楝子活血理氣止痛，使瘀阻胞宮沖任之瘀血、濕濁、濕熱之邪有去路，血液循經(jīng)而行，沖任氣機順暢，經(jīng)行通暢，“通則不痛”。由于慢性盆腔痛病位在盆腔，經(jīng)直腸給藥可直接通過腸壁滲透藥液，直接改善盆腔微環(huán)境，使藥力直達(dá)病所，亦可減少長期服用苦寒藥物對胃的刺激。前期研究表明采用盆痛靈直腸給藥治療EMs所致的慢性盆腔疼痛患者療效顯著[6]。

有研究認(rèn)為，EMs致痛機制與疾病本身的病因一樣復(fù)雜，炎癥反應(yīng)、雌激素、神經(jīng)纖維損傷再生、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常等均有可能成為致痛因素[7]。本課題通過大鼠EMs模型模擬人類EMs的臨床癥狀，實驗中當(dāng)機械性壓力增大時大鼠出現(xiàn)后肢收縮與臨床上很多痛經(jīng)患者檢查時拒按腹部或者出現(xiàn)腹肌緊張狀態(tài)，癥狀類似。因此本課題主要選用大鼠的機械痛閾值作為造模成功與否和藥物鎮(zhèn)痛療效的疼痛行為學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)。大鼠造模后機械痛閾值明顯降低，且隨著時間延長，大鼠內(nèi)異病灶體積逐漸增大，而大鼠的機械痛閾值呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，與內(nèi)異灶的浸潤、生長有關(guān)，同理，EMs病灶浸潤越深患者盆腔疼痛感越強烈，同時也可能與病灶粘連程度相關(guān)，粘連程度越高，疼痛越強烈[8]。對EMs模型大鼠二次開腹時發(fā)現(xiàn)盆腔粘連，亦證實此觀點。然假手術(shù)組造模前后機械痛閾值無顯著性差異，說明手術(shù)或者結(jié)扎大鼠子宮造成的炎癥并不會影響大鼠的痛閾值。盆痛靈方及消炎痛片直腸給藥后EMs模型大鼠的機械痛閾值呈上升趨勢，隨著治療時間增加，大鼠機械痛閾值上升越明顯，且盆痛靈方高劑量組鎮(zhèn)痛效果最優(yōu)，而盆痛靈方低劑量組與消炎痛組上升程度相當(dāng)，說明盆痛靈方鎮(zhèn)痛作用與時間、濃度呈正比，且低劑量盆痛靈方的鎮(zhèn)痛作用與消炎痛片相當(dāng)。

眾所周知內(nèi)異癥疼痛的痛覺是一種內(nèi)臟痛，疼痛沖動是經(jīng)過副交感神經(jīng)(盆神經(jīng))傳到脊髓的，在脊髓背角換元，其軸突可在同側(cè)或?qū)?cè)脊髓前外側(cè)索上行，達(dá)丘腦，然后投射到大腦皮質(zhì)?？烧J(rèn)為異位的子宮內(nèi)膜作為一種傷害性刺激引起種植部位的外周組織釋放和生成多化學(xué)和細(xì)胞因子，可能參與激活和調(diào)制傷害性感受器。目前認(rèn)為可能與局部前列腺素增高、炎性因子異常以及異位病灶機械性牽拉等有關(guān)，但其明確的發(fā)病機制至今仍然不清。

有研究發(fā)現(xiàn)，EMs 患者不同類型的異位病灶均有NGF 的高表達(dá)，且與患者疼痛癥狀的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[9]。NGF導(dǎo)致疼痛可能存在外周機制：可能與釋放PGs及相關(guān)炎癥因子有關(guān)，NGF促炎癥因子釋放作用主要通過肥大細(xì)胞實現(xiàn)，NGF可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放大量組胺、肝素、腫瘤壞死因子、蛋白酶、IL、5羥色胺等炎癥介質(zhì)致敏傷害性感受器，繼而導(dǎo)致疼痛[10]。同時肥大細(xì)胞也可釋放NGF[11]，使炎癥信號進(jìn)一步放大。NGF 可以被炎癥性細(xì)胞因子正調(diào)解，致炎因子IL-1β和TNF-α 能刺激NGF 的表達(dá)。另一方面，內(nèi)異癥患者腹腔液中IL1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子含量增高，浸潤神經(jīng)可分泌P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)蛋白、氨基丁酸、神經(jīng)肽、5羥色胺等致痛物質(zhì)，其中P物質(zhì)、CGRP 和神經(jīng)肽可以調(diào)節(jié)疼痛的中樞傳導(dǎo)過程[12]。因此可以假定，內(nèi)異灶中的NGF及其受體含量增高通過外周及中樞機制引發(fā)EMs疼痛。

本研究表明異位內(nèi)膜種植后，EMs大鼠內(nèi)異灶周圍的腹腔液中NGF和炎癥因子IL-1β、TNF-α濃度均升高，同時發(fā)現(xiàn) EMs大鼠血清中NGF和炎癥因子IL-1β、TNF-α濃度均升高。通過中藥干預(yù)后，與模型組比較，西藥和盆痛靈高、中劑量組血清及腹腔液中NGF和IL-1β、TNF-α水平均降低，盆痛靈低劑量組血清中IL-1β降低，因此認(rèn)為盆痛靈的作用機理可能跟調(diào)控NGF的水平、減少炎癥因子有關(guān)，但是否通過外周及中樞調(diào)控EMs疼痛的確切機制有待進(jìn)一步的研究證實。