周姍， 栗樹(shù)珍， 鐘慧， 賀治國(guó)

1.中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院, 生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長(zhǎng)沙 410083;

2.中南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013

引 言

A.ferrooxidans是一種革蘭氏陰性、嗜酸、自養(yǎng)型細(xì)菌，能夠利用氧作為電子受體，將亞鐵氧化為三價(jià)鐵，或?qū)钨|(zhì)硫/還原性無(wú)機(jī)硫化合物氧化為硫酸鹽而獲得生長(zhǎng)所需的能量[1]。這種特殊的代謝特征使其成為酸性礦山廢水(Acid mine drainage)形成和金屬硫化礦生物浸出生產(chǎn)中的關(guān)鍵微生物之一[1]，被作為生物冶金模式微生物[2,3]。A.ferrooxidans細(xì)胞表面的酸堿性質(zhì)在其與金屬硫化礦的黏附、對(duì)金屬硫化礦的氧化以及對(duì)酸性礦山廢水中重金屬離子的吸附方面起著至關(guān)重要的作用。

近年來(lái)，通過(guò)細(xì)胞在礦物表面的吸附行為研究對(duì)A.ferrooxidans細(xì)胞的表面性質(zhì)有了一定了解[4-6]，如Zhu等人研究發(fā)現(xiàn)S0、Fe2+或CuFeS2培養(yǎng)的A.ferrooxidans表面疏水性、凈電荷及與黃銅礦間的吸附力不同，從而對(duì)黃銅礦中銅的浸出效率也不同[5]，Li等人研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的胞外多聚物(EPS)決定著細(xì)胞的表面性質(zhì)，從而決定了A.ferrooxidans細(xì)胞在黃銅礦表面的吸附行為[6]。找出不同培養(yǎng)條件及離子強(qiáng)度如何影響A.ferrooxidans細(xì)胞的表面特性，將有助于闡明A.ferrooxidans細(xì)胞對(duì)酸性礦山廢水中重金屬吸附和遷移的影響，并通過(guò)改變細(xì)胞表面性質(zhì)提高A.ferrooxidans對(duì)金屬硫化礦的浸出效率，然而目前相關(guān)研究仍然缺乏。

模擬細(xì)菌細(xì)胞壁表面的質(zhì)子模型，對(duì)理解細(xì)菌表面發(fā)生的反應(yīng)和物質(zhì)傳輸有重要作用[8]。目前已有許多針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁質(zhì)子化反應(yīng)的電位滴定研究，但是基于這些電位滴定試驗(yàn)結(jié)果的建模方法又不盡相同。例如，Plette[9]等整合了3個(gè)位點(diǎn)的Langmuir-freundlich模型和gibbs-donnan shell模型，來(lái)模擬RhodococcuserythropolisA177的酸堿滴定結(jié)果。Fein[10]等對(duì)Bacillussubtilis進(jìn)行了電位滴定，并且把細(xì)胞壁分為三個(gè)獨(dú)立功能組，然后利用恒定電容模型模擬三組的電位變化，Cox[11]等做了相似的試驗(yàn)，但是用了一種不同的建模方法，即非靜電線性編程方法，利用5個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)模擬滴定結(jié)果。而Martinez[12]等利用Gibbs-donnan shell模型并兼顧一系列均衡分布的pKa值模擬了Bacillussubtilis和Escherichiacoli的滴定結(jié)果，并且找到了證據(jù)支持可以把細(xì)菌表面分為四個(gè)功能區(qū)。盡管已有大量工作研究其它微生物的表面化學(xué)特性[9-14]，以完善表面絡(luò)合模型，用于解釋和預(yù)測(cè)微生物在各種條件下的質(zhì)子/重金屬吸附行為，目前還沒(méi)有研究系統(tǒng)地報(bào)道過(guò)極端嗜酸菌A.ferrooxidans的表面質(zhì)子吸附/解吸附規(guī)律。細(xì)菌表面官能團(tuán)種類繁多，位點(diǎn)復(fù)雜，研究表明細(xì)菌表面上最常見(jiàn)的有機(jī)酸官能團(tuán)是羧基、羥基和磷?；?，氨基和巰基的含量較小，整合太少位點(diǎn)的表面絡(luò)合模型不能很好地進(jìn)行擬合[15]。Borrok等人將四位點(diǎn)、無(wú)靜電吸附的表面絡(luò)合模型作為通用模型對(duì)超過(guò)35個(gè)菌種/細(xì)菌群落的225個(gè)滴定數(shù)據(jù)集進(jìn)行了擬合，之后，Turner和Fein發(fā)現(xiàn)盡管四位點(diǎn)的無(wú)靜電吸附模型可以合理地描述滴定數(shù)據(jù)，但獲得的菌的緩沖值 “峰值”比預(yù)期要寬[16]。相對(duì)于四位點(diǎn)的無(wú)靜電吸附模型，三位點(diǎn)的固定電容模型比較適合對(duì)細(xì)菌表面質(zhì)子化擬合[13,16]。He等的研究也發(fā)現(xiàn)對(duì)于嗜酸菌Acidianusmanzaensis的表面質(zhì)子化擬合，三位點(diǎn)的Donnan殼模型適用，兩位點(diǎn)模型不能夠提供很好的擬合，四位點(diǎn)模型也沒(méi)有提升擬合度[17]。該研究中即采用三位點(diǎn)模型，使用被很多研究采用的能夠優(yōu)化表面質(zhì)子化模型的ProtoFit[16]來(lái)進(jìn)行酸堿滴定數(shù)據(jù)擬合，對(duì)A.ferrooxidans進(jìn)行表面質(zhì)子化模擬。ProtoFit作為一種質(zhì)子化模型的工具，它可以用表面離散模型(DLM)、固定電容模型(CCM)、Donnan殼模型(DSM)和無(wú)靜電吸附模型(NEM)四種表面絡(luò)合模型中的一種來(lái)對(duì)1-4種表面功能基團(tuán)位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化擬合從而得出該位點(diǎn)的pKa和位點(diǎn)濃度[18]。

該研究中，考察了pH值、離子強(qiáng)度和培養(yǎng)能源(S0、Fe2+、FeS2)對(duì)A.ferrooxidans細(xì)胞的表面酸堿性質(zhì)的影響。先后進(jìn)行了酸堿滴定和ProtoFit質(zhì)子模擬，并通過(guò)電泳遷移率測(cè)量和傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)評(píng)估細(xì)胞壁上的電荷密度和官能團(tuán)分布。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

試驗(yàn)用到的主要儀器設(shè)備有雷磁ZDJ-5自動(dòng)電位滴定儀(上海精密儀器儀表有限公司)、Avanti J-E離心機(jī)(Beckman Coulter, Inc.)、PHS-3C pH計(jì)(上?？祪x儀器有限公司)、Nicolet Model Nexus 670 傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)尼高力公司)、YXQ-LS-SII立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、XMTE-7000數(shù)控恒溫浴鍋(余姚市長(zhǎng)江溫度儀表廠)。

試驗(yàn)菌株為AcidithiobacillusferrooxidansA9，采用改進(jìn)的9K基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方為：(NH4)2SO43 g，KCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca(NO3)20.01 g，加蒸餾水1 000 mL。培養(yǎng)基的初始pH值用H2SO4調(diào)節(jié)至2.0，分裝于錐形瓶中，120 ℃滅菌20 min。添加S0(10 g/L)、FeSO4·7H2O(44.7 g/L)或者黃鐵礦(2%)作為生長(zhǎng)的能源物質(zhì)，S0和FeSO4·7H2O等藥品均為分析純(AR)，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。將接種了A.ferrooxidans的錐形瓶置于30 ℃、180～200 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)。

試驗(yàn)用黃鐵礦(FeS2)由生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，粒度≤0.074 mm。經(jīng)測(cè)定，黃鐵礦礦樣中元素Fe的質(zhì)量百分比為44.46%，S為47.78%。X射線衍射物相分析(結(jié)果見(jiàn)圖1)結(jié)果表明礦樣可作為純礦物使用，雜質(zhì)為石英。

圖1 黃鐵礦X射線衍射圖

1.2 試驗(yàn)方法

當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)到穩(wěn)定期時(shí)，10 000 r/min離心15 min收集菌體。收集的菌體懸浮于0.001 mol/L、0.01 mol/L或0.1 mol/L的背景電解質(zhì)NaNO3溶液中，在25 ℃進(jìn)行電位滴定試驗(yàn)。滴定前，用純度大于99.99%的氮?dú)鉁焓?.5 h以趕走溶液中的二氧化碳，使pH值保持在4～5之間。電位滴定試驗(yàn)按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[15]進(jìn)行，菌懸液先用0.1 mol/L HNO3溶液調(diào)整pH值至2.0，然后用0.01 mol/L NaOH在電位漂移率≤5 mV/min(0.1 mV/Sec)時(shí)持續(xù)加入堿，滴定至pH值為10。為了檢測(cè)可逆性和質(zhì)子化行為進(jìn)行了逆向滴定，即在到達(dá)滴定終點(diǎn)(pH值為10)后，用0.1 mol/L HNO3溶液迅速滴定到pH值為2，記錄過(guò)程中所用HNO3溶液的體積。整個(gè)滴定過(guò)程保持較低壓力的氮?dú)饩徛赝ㄈ刖鷳乙?。滴定結(jié)束后，對(duì)酸堿滴定結(jié)果進(jìn)行擬合。利用ProtoFit軟件將原始滴定數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理，得到最優(yōu)化模擬數(shù)據(jù)，根據(jù)最優(yōu)數(shù)據(jù)模擬出質(zhì)子模型，并與原始滴定數(shù)據(jù)作比較以檢驗(yàn)將質(zhì)子模型應(yīng)用于極端嗜酸微生物A.ferrooxidans表面酸堿性質(zhì)研究的適用性。

為了進(jìn)行電泳遷移率測(cè)量，菌體離心收集、洗滌后重懸于0.001 mol/L、0.01 mol/L或0.1 mol/L的NaNO3溶液中，保存在冰上。將三個(gè)不同離子濃度的NaNO3溶液的等分試樣(10 mL)通過(guò)分別添加1 mol/L HNO3溶液或1 mol/L NaOH溶液，調(diào)整為不同的pH值(2～10)。在電泳遷移率測(cè)量之前，將這些樣品和相應(yīng)離子強(qiáng)度的細(xì)菌懸浮液混合，并測(cè)定最終pH值。使用Zeta電位和粒度分析儀(Delsa 440SX)在25 ℃下測(cè)量電泳遷移率。所有試驗(yàn)均設(shè)置三個(gè)平行。

FTIR分析：配制不同pH值的0.01 mol/L的NaNO3溶液制備細(xì)菌懸液，利用FTIR分光光度計(jì)測(cè)定吸光值[18]。每一個(gè)pH值條件下，在4 000 cm-1～950 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)，以4 cm-1的分辨率進(jìn)行100次測(cè)定。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同能源培養(yǎng)的A. ferrooxidans不同離子強(qiáng)度酸堿滴定曲線

電位滴定曲線見(jiàn)圖2(a-c)，結(jié)果表明，三種不同能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans在pH值2～4間均有很強(qiáng)的緩沖能力。一些研究發(fā)現(xiàn)去質(zhì)子化過(guò)程就是細(xì)菌表面的酸性位點(diǎn)對(duì)溶液中不斷加入的堿性溶液的一種緩沖現(xiàn)象[17,19]，在該研究中得到了相同的結(jié)論。滴定過(guò)程中滴定儀實(shí)時(shí)顯示的滴定曲線表明細(xì)菌懸浮液的第一次pH值升高和第二次pH值降低的滴定之間具有極好的一致性(圖片未展示)，表明在滴定試驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)(約2 h)，質(zhì)子吸附和解吸是完全可逆的。每種離子強(qiáng)度下，質(zhì)子在細(xì)菌上的吸附程度隨pH值的增加而降低。滴定數(shù)據(jù)還表明，培養(yǎng)能源對(duì)細(xì)菌的緩沖能力有很大的影響。整體上，以S0為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans具有最強(qiáng)的緩沖能力，以Fe2+為能源的次之，而FeS2培養(yǎng)的最弱。在Li等人的研究中，在0.01 M NaCl溶液作為背景電解質(zhì)的離子強(qiáng)度下，F(xiàn)e2+為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的緩沖能力也低于以S0為能源的，但以CuFeS2為能源的緩沖能力最強(qiáng)[6]。離子強(qiáng)度對(duì)不同能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans細(xì)胞的緩沖能力表現(xiàn)出不同的影響。S0培養(yǎng)的A.ferrooxidans在0.1 mol/L的NaNO3溶液中緩沖能力最好，當(dāng)0.01 mol/L NaOH用量為110 mL時(shí)，滴定曲線才基本平衡。FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans在0.001 mol/L的NaNO3溶液中緩沖能力最好，NaOH用量為42 mL時(shí)滴定趨于平衡。而A.ferrooxidans以Fe2+為能源培養(yǎng)后對(duì)0.01 mol/L NaNO3溶液緩沖能力好，NaOH用量在53 mL左右時(shí)去質(zhì)子化基本達(dá)到平衡。

圖2 S0(a)、Fe2+(b)、FeS2(c)培養(yǎng)的A. ferrooxidans不同離子強(qiáng)度酸堿滴定曲線

測(cè)量的pH值(x軸)與在滴定過(guò)程中消耗或釋放的質(zhì)子(y軸)相對(duì)于離子強(qiáng)度的歸一化結(jié)果如圖3所示，便于直觀比較不同離子強(qiáng)度下的結(jié)果。縱坐標(biāo)數(shù)據(jù)根據(jù)公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

圖3 S0(a)、Fe2+(b)、FeS2(c)培養(yǎng)的A. ferrooxidans不同離子強(qiáng)度質(zhì)子吸附/解吸附結(jié)果

[H+]consumed/released=(Ca-Cb-[H+]+[OH-])/mb

(1)

其中Ca和Cb是滴定過(guò)程添加的酸和堿的濃度，單位為mol/L，mb是細(xì)菌的濕重懸浮液濃度(g/L)。

質(zhì)子吸附/解吸附曲線表明不同能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans細(xì)胞的表面存在pKa值相近的官能團(tuán)，且在所研究的整個(gè)pH值范圍內(nèi)發(fā)生了大量的質(zhì)子吸附/解吸附。在三種不同的離子強(qiáng)度溶液中，三種不同能源培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯不同的位點(diǎn)濃度。在0.01 mol/L電解質(zhì)溶液中，以Fe2+為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans細(xì)胞的位點(diǎn)濃度是以S0為能源條件下的兩倍，是FeS2為能源條件下五倍。對(duì)于以S0為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans，在0.01 mol/L電解質(zhì)溶液中的總位點(diǎn)濃度明顯低于在另外兩個(gè)研究的離子強(qiáng)度下的，而以Fe2+為能源的在0.01 mol/L離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液中總位點(diǎn)濃度最高。以FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans細(xì)胞在三種離子強(qiáng)度下總位點(diǎn)濃度無(wú)顯著差異。

之前的研究報(bào)道表明[17]，嗜酸嗜熱古菌A. manzaensis在0.01 mol/L的NaNO3溶液中能緩沖大量的NaOH，在滴定達(dá)到平衡的時(shí)候NaOH的用量達(dá)到50 mL；在0.001 mol/L的NaNO3溶液中NaOH用量為47 mL；而在0.1 mol/L NaNO3溶液中其緩沖能力最差，只消耗35 mL 0.01 mol/L的NaOH溶液即基本達(dá)到平衡。Tourney等[20]研究了革蘭氏陽(yáng)性嗜熱菌Bacillus licheniformis S-86的電位滴定，發(fā)現(xiàn)在所研究的范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度對(duì)去質(zhì)子化常數(shù)或位點(diǎn)濃度沒(méi)有顯著影響。而B(niǎo)urnett等[18]得出結(jié)論，隨著離子強(qiáng)度的增加，Anoxybacillus flavithermus的緩沖能力增加。Johnson[21]的研究表明，革蘭氏陰性細(xì)菌Shewanella putrefaciens在好氧和厭氧條件下表現(xiàn)出完全不同的酸堿性質(zhì)，這些差異遠(yuǎn)大于不同培養(yǎng)基配方或菌齡引起的差異。但是，該研究中生長(zhǎng)能源(S0、Fe2+、 FeS2)顯著影響了A.ferrooxidans的表面特性，導(dǎo)致離子強(qiáng)度對(duì)不同能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans細(xì)胞表面緩沖能力的影響也不同。

2.2 ProtoFit模擬

該研究采用DSM(Donnan殼的靜電模型)來(lái)模擬不同離子強(qiáng)度條件的滴定，利用每組滴定數(shù)據(jù)計(jì)算出不同能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans細(xì)胞表面位點(diǎn)的logK值和位點(diǎn)濃度(表 1)。

表1 不同能源培養(yǎng)的A. ferrooxidans及一些生物表面的表面特性

根據(jù)文獻(xiàn)[11,12,25]，羧基的解離常數(shù)為2～6，磷酸鹽基團(tuán)的解離常數(shù)一般為5.6～7.2，伯胺的解離常數(shù)大于10，氨基的解離常數(shù)為7～9，羥基的解離常數(shù)為8.6～9。該研究中，根據(jù)ProtoFit軟件模擬得到的去質(zhì)子化常數(shù)可以推測(cè)A.ferrooxidans細(xì)胞表面存在羧基、磷酸鹽基團(tuán)和伯胺。

圖4 S0(a)、Fe2+(b)、FeS2(c)培養(yǎng)的A. ferrooxidans不同離子強(qiáng)度電泳遷移率

2.3 電泳遷移率分析

電泳遷移率可以估算出整個(gè)細(xì)菌表面電荷及其等電點(diǎn)，圖3為不同能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans在不同離子強(qiáng)度下的電泳遷移率。數(shù)據(jù)表明，A.ferrooxidans在pH值范圍內(nèi)(2～10)均呈負(fù)電性。隨著pH值的升高，A.ferrooxidans表面的負(fù)電荷增加，符合微生物表面帶電的一般特性[26]。有研究報(bào)道電泳遷移率隨離子強(qiáng)度的增加而降低[27]，但該研究的結(jié)果并不支持這一結(jié)論。目前關(guān)于離子強(qiáng)度對(duì)細(xì)菌質(zhì)子化參數(shù)影響的研究尚未達(dá)成共識(shí)[20]。該研究中觀察到細(xì)胞的電泳遷移率取決于許多因素，例如pH值、離子強(qiáng)度和培養(yǎng)能源，并且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)能源極大地影響了細(xì)菌的電泳遷移率。對(duì)于以S0或Fe2+為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans細(xì)胞，pH值對(duì)電泳遷移率的影響隨離子強(qiáng)度的增加而增加(斜率變陡)，而對(duì)于以FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans細(xì)胞，該研究中得到了相反的結(jié)論。結(jié)果還表明，培養(yǎng)能源顯著影響A.ferrooxidans細(xì)胞的等電點(diǎn)。以S0為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的等電點(diǎn)(IEP)約為2.0，并且不受溶液離子強(qiáng)度的影響。對(duì)于以Fe2+或FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans，即使在研究的最低pH值下也未觀察到IEP。

2.4 A. ferrooxidans的ATR-FTIR圖譜分析

進(jìn)一步采用ATR-FTIR分析在不同的pH值條件下，不同能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans表面官能團(tuán)的分布規(guī)律。圖5是以S0、Fe2+或FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans在pH值為2.02、4.04、5.66、7.97和9.7條件下的ATR-FTIR圖譜。表2總結(jié)了在不同pH值下以S0、Fe2+或FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的主要官能團(tuán)的特征峰的比較。結(jié)果表明，A.ferrooxidans的紅外圖譜顯示出較大的差異，與培養(yǎng)能源和pH值相關(guān)。

表2 不同pH值下以S0、Fe2+或FeS2為能源培養(yǎng)的A. ferrooxidans表面主要官能團(tuán)的比較

以S0為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans，pH值為4.04、5.66和7.92時(shí)的吸收峰較多，主要分布在1 000 cm-1～1 200 cm-1和1 500 cm-1～1 700 cm-1范圍內(nèi)，pH 值為2.01和pH值為9.7時(shí)的圖譜沒(méi)有明顯的吸收峰。1 044 cm-1處的吸收峰在pH值為2.01時(shí)比較弱，與1 083 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度幾乎一樣。之后隨著溶液堿性增加，1 044 cm-1處的吸收慢慢增強(qiáng)，在pH值為7.92時(shí)的譜帶中達(dá)到最大，是1 083 cm-1處的吸收峰的5倍以上。但是，在pH值為9.7時(shí)的譜帶中沒(méi)有這兩個(gè)吸收峰。1 500 cm-1～1 600 cm-1范圍內(nèi)各pH值條件下的譜帶也有明顯區(qū)別：在pH值為2.01時(shí)的譜帶中，這個(gè)范圍的吸收峰較弱；在pH值為4.04和5.66的譜帶中，這個(gè)范圍的吸收峰寬度和強(qiáng)度都很相似。pH 值為7.92的譜帶中，1 630 cm-1處的吸收峰變得很強(qiáng)，主要是由氨基與蛋白連接的C=O基團(tuán)的伸縮引起的特征吸收峰。酰胺Ⅱ類和酰胺Ⅰ類的吸收峰分別出現(xiàn)在1 538 cm-1、1 546 cm-1和1 630 cm-1處，酰胺Ⅱ類與酰胺Ⅰ類的比值隨著pH值的上升而增大，但是在pH值為9.7時(shí)兩個(gè)吸收峰不明顯。

以Fe2+為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的ATR-FTIR圖譜見(jiàn)圖5 (b)。仲醇C-O基團(tuán)的吸收峰隨著pH值的上升位置有所偏移，從pH值為2.01的1 072 cm-1，到pH值為5.66時(shí)的1 080 cm-1，到pH值為7.92時(shí)的1 084 cm-1；而且在pH值≥4.04時(shí)，逐漸分出伯醇C=O基團(tuán)的吸收峰，在pH值為7.92時(shí)仲醇C-O基團(tuán)和伯醇C=O基團(tuán)的吸收峰最強(qiáng)。1 650 cm-1～1 550 cm-1為酰胺Ⅰ類和酰胺Ⅱ類的吸收峰。酰胺Ⅱ類的吸收隨pH值的上升而減弱，酰胺Ⅰ類的吸收隨pH值的上升而增強(qiáng)。酰胺Ⅰ類與酰胺Ⅱ類在pH值為9.7時(shí)吸收峰不明顯。

圖5 S0(a)、Fe2+(b)和FeS2(c)培養(yǎng)的A. ferrooxidans在不同pH值的ATR-FTIR圖譜

圖5(c)是以FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的ATR-FTIR譜圖。吸收峰主要集中在1 260 cm-1～1 000 cm-1和1 640 cm-1～1 600 cm-1兩個(gè)波段。1 260 cm-1～1 000 cm-1被復(fù)雜的疊加振動(dòng)所控制，主要為C-O-C和C-O-P的伸縮振動(dòng)，這些基團(tuán)涉及復(fù)雜的多糖群體。pH值為4.04和7.92的譜帶中沒(méi)有較強(qiáng)的吸收峰。1 084 cm-1的吸收峰隨pH值的上升其吸收減弱，而且吸收波段有所遷移，pH值為9.7時(shí)在1 077 cm-1。酰胺Ⅱ類和酰胺Ⅰ類的吸收峰分別出現(xiàn)在1 547 cm-1、1 545 cm-1和1 646 cm-1處。酰胺Ⅱ類與酰胺Ⅰ類的比值隨著pH值的上升而減弱，但是在pH值為9.7時(shí)酰胺Ⅱ類吸收峰明顯。相對(duì)以S0或Fe2+為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的譜圖，以FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的譜圖吸收峰較多，沒(méi)有像以S0或Fe2+為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的譜圖一樣出現(xiàn)明顯的特征吸收峰。

這些有酸堿活性的羧基、酰胺基和磷酸基等官能團(tuán)在電位滴定過(guò)程中起到重要的作用，不同能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans表面官能團(tuán)分布的差異影響了其質(zhì)子吸附/解吸附規(guī)律。

3 結(jié)論

該研究將酸堿電位滴定結(jié)合表面絡(luò)合理論用于極端嗜酸菌A.ferrooxidans的酸堿緩沖能力的解析。結(jié)果表明，A.ferrooxidans的表面性質(zhì)受到能源、離子強(qiáng)度和pH值的影響。隨著pH值的升高，緩沖容量也增加，導(dǎo)致表面負(fù)電荷增加。ProtoFit擬合結(jié)果表明以S0為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans表面的總位點(diǎn)濃度高于以Fe2+或FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans。根據(jù)選擇的DSM模型，可以通過(guò)調(diào)用三種不同類型的細(xì)胞壁官能團(tuán)來(lái)表征A.ferrooxidans細(xì)胞壁的酸堿性質(zhì)：羧基、磷酸基和酰胺基，并通過(guò)ATR-FTIR得到了驗(yàn)證。與S0為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans相比，以FeS2為能源培養(yǎng)的A.ferrooxidans的表面官能團(tuán)具有更高的多樣性。該研究將表面絡(luò)合理論擴(kuò)展到冶金模式微生物A.ferrooxidans，結(jié)果同樣適用，該研究可以為A.ferrooxidans及其它嗜酸微生物的表面性質(zhì)的研究提供重要參考。