，，，，，

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) a.果樹研究所；b.果樹種質(zhì)創(chuàng)制和利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

棗Ziziphus jujubaMill.為鼠李科Rhamnaceae棗屬ZiziphusMill.植物，原產(chǎn)于我國(guó)，我國(guó)棗栽培的歷史悠久，棗品種資源豐富。棗是我國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)林樹種之一，也是我國(guó)的第一大干果樹種[1-2]。棗果實(shí)富含多糖、環(huán)核苷酸（cAMP 和cGMP）、黃酮、三萜酸、皂苷等生物活性成分[3-4]，是名貴的天然保健食品和重要的藥用材料，被國(guó)家衛(wèi)生部列為“藥食同源”食品[5]。黃酮類物質(zhì)是棗果中重要的功能性營(yíng)養(yǎng)成分之一[6]，近年來(lái)因其具有天然生物活性而受到人們的廣泛關(guān)注。已有研究結(jié)果表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠、降血脂、降血壓、護(hù)肝保肝等生理功能[7-9]。因此，研究棗種質(zhì)果實(shí)中黃酮的含量及抗氧化活性對(duì)于棗種質(zhì)的鑒定評(píng)價(jià)和資源利用均有重要意義。

目前，有關(guān)棗種質(zhì)中黃酮類物質(zhì)的研究主要集中在提取工藝優(yōu)化和栽培品種含量分析等方面。張瓊等[10]比較分析了以溶劑超聲浸提法、微波法和簡(jiǎn)化QuEChERS 法提取棗果黃酮的效率，并對(duì)提取工藝的各參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用簡(jiǎn)化QuEChERS 法可在30 min 內(nèi)有效提取棗果黃酮。周曉鳳等[11]采用紫外分光光度法測(cè)定了10 個(gè)棗品種果實(shí)中總黃酮的含量，結(jié)果表明，各品種的平均含量為3.07 mg·g-1。然而，前人針對(duì)棗果實(shí)中黃酮的抗氧化能力的研究報(bào)道較少。袁亞娜等[12]研究了冬棗黃酮粗提物及其純化物對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH 自由基的清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冬棗黃酮類物質(zhì)具有很好的抗氧化效果，并存在劑量效應(yīng)關(guān)系。Gao 等[13]采用DPPH、ABTS 自由基清除能力及總還原力等評(píng)價(jià)方法測(cè)定了10 個(gè)栽培棗品種果實(shí)的抗氧化能力，結(jié)果表明，棗果實(shí)均表現(xiàn)出較高的Trolox（抗氧化劑）當(dāng)量抗氧化能力，供試的10 個(gè)品種中，‘佳縣木棗’的抗氧化能力最強(qiáng)。但是，關(guān)于酸棗資源、觀賞資源、栽培品種等不同類型棗種質(zhì)果實(shí)中黃酮及其抗氧化活性的系統(tǒng)研究尚未見諸報(bào)道。弄清不同類型種質(zhì)資源棗果中的黃酮含量，是其資源合理開發(fā)與利用的前提。為此，從國(guó)家棗種質(zhì)資源圃中選擇了50 份具有代表性的棗種質(zhì)，對(duì)其果實(shí)中的黃酮含量及分別以FRAP 法、DPPH 法、ABTS 法等評(píng)價(jià)方法測(cè)得的抗氧化活性進(jìn)行了比較分析，還研究了黃酮含量與抗氧化活性間的相關(guān)性，以篩選出黃酮含量高且抗氧化活性強(qiáng)的優(yōu)特異棗種質(zhì)，從而為棗黃酮代謝機(jī)理的研究和黃酮功能產(chǎn)品研發(fā)時(shí)的原料選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016—2018年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所果樹種質(zhì)創(chuàng)制和利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，從國(guó)家棗種質(zhì)資源圃中選取50 份具有代表性的棗種質(zhì)脆熟期的果實(shí)（棗果半紅至多半紅）為試材。采樣樹為13年生的結(jié)果樹，其種植密度為2.5 m×3.0 m，其栽培條件和管理水平均一致。在果實(shí)脆熟期，將采集的樣品依次用自來(lái)水、蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，切成薄片，置于65 ℃的恒溫干燥箱中烘至恒重后粉碎，過80 目篩，然后置于-20 ℃的冰箱中保存以備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮提取液的制備

精密稱取待測(cè)樣品各3 份，每份2.000 g，將60%的乙醇20 mL 加入至50 mL 的離心管中，超聲提取60 min，以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，重復(fù)提取2次，合并上清液，再以60%的乙醇定容至刻度，即可得到測(cè)定黃酮含量和抗氧化活性所用的提取液。

1.2.2 黃酮含量的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定，采用NaNO2-AI(NO3)3-NaOH比色法，參照Z(yǔ)hao 等[14]的方法（略有改動(dòng)）進(jìn)行操作。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 抗氧化活性的測(cè)定

采用FRAP 法[15]測(cè)定提取物的總還原力，其抗氧化活性以AAE 當(dāng)量（g·kg-1）表示。

參考Yemis 等[16]和Brand-Williams 等[17]的方法（有所改進(jìn)），采用黃酮提取液對(duì)DPPH 自由基的清除能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性。操作步驟如下：精密稱取DPPH 0.039 4 g，用無(wú)水乙醇溶解后定容于500 mL 的棕色容量瓶中（每天所用的DPPH溶液都是現(xiàn)用現(xiàn)配的），于4 ℃黑暗條件下保存以備用。將配好的DPPH 溶液1 mL 加入到盛有2 mL 稀釋后的黃酮提取液的試管中，立即搖勻，于室溫黑暗條件下培養(yǎng)30 min，然后用分光光度計(jì)測(cè)定517 nm 處的吸光度，記為Ac(t)；再以60%的乙醇代替黃酮提取液，測(cè)定517 nm 處的吸光度，記為Ac(0)。以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)設(shè)置不同濃度梯度，以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度的變化值（Ac(0)-Ac(t)）為縱坐標(biāo)，建立的回歸方程為：Y=0.464 6X-0.090 7，R2=0.993 1。提取液的抗氧化活性，用TE（Trolox當(dāng)量）表示，其計(jì)量單位為mmol·g-1。

參考Nenadis 等[18]和于洋[19]的方法（有所改動(dòng)），采用黃酮提取液對(duì)ABTS+·自由基的清除能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性。操作步驟如下：精密稱取ABTS 40.00 mg，將其溶解于10 mL 的蒸餾水中，加入1.0 mg·mL-1的過硫酸鉀8.00 mL，于室溫避光條件下靜置16 h，轉(zhuǎn)移到250 mL 的容量瓶中，再加入32 mL 的蒸餾水，用無(wú)水乙醇定容至刻度，放置10 h 以備用。將配置好的ABTS 溶液稀釋，在734 nm 處測(cè)定到的吸光值約為0.7。將2 mL 稀釋后的ABTS 溶液加入到盛有2 mL 稀釋后的黃酮提取液的試管中，靜置30 min，并測(cè)定734 nm 處的吸光度，記為Ai；以60%的乙醇代替黃酮提取液，測(cè)定734 nm 處的的吸光度，記為A0。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)設(shè)置不同濃度梯度，以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度的變化值（A0-Ai）為縱坐標(biāo)，建立的回歸方程為：Y=0.694 7X+0.003 6，R2=0.997 6。提取液的抗氧化活性，用TE（Trolox 當(dāng)量）表示，其計(jì)量單位為mmol·g-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft excel 2003 和SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗種質(zhì)果實(shí)黃酮含量分析

供試的50 份棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)中黃酮含量的分析結(jié)果見表1。由表1可知，不同棗種質(zhì)間果實(shí)中的黃酮含量具有豐富的多樣性。50 份棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)中的黃酮含量為1.46 ～22.50 mg·g-1，其平均值為5.78 mg·g-1，其變幅為22.04，其變異系數(shù)為68.26%。其中，黃酮含量最高的種質(zhì)為北京老虎眼，其含量高達(dá)22.50 mg·g-1；含量最低的種質(zhì)是羊奶棗，其含量為1.46 mg·g-1；前者是后者的14.41 倍。高于平均含量的種質(zhì)有17 份，低于平均含量的種質(zhì)有33 份。

表1 50份棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)中的總黃酮含量Table1 Total flavonoid contentsin50 Chinesejujubecrisp ripening fruits mg·g-1

Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，50 份棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)中黃酮含量的分布規(guī)律表現(xiàn)為正態(tài)分布規(guī)律（P=0.053 ＞0.05）。50 份棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)中的黃酮含量分布頻率的分析結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，50 份棗種質(zhì)果實(shí)中，大部分種質(zhì)棗果中黃酮含量的分布范圍為3.33 ～5.00 mg·g-1，此類種質(zhì)有16 份，占供試種質(zhì)總數(shù)的32.00%；其次是黃酮含量分布范圍分別為5.00 ～6.67、1.67 ～3.33、6.67 ～8.33 mg·g-1的種質(zhì)，其種質(zhì)份數(shù)分別有12、9、6 份，分別占供試種質(zhì)總數(shù)的24.00%、18.00%、12.00%；而其他含量分布范圍的種質(zhì)較少，如黃酮含量分別為10.00 ～11.67 與15.00 ～16.67 mg·g-1的種質(zhì) 份 數(shù)分別有3 和2 份，分別占供試種質(zhì)總數(shù)的6.00%和4.00%；黃酮含量最低（小于1.67 mg·g-1）和最高（大于20.00 mg·g-1）的種質(zhì)各有1 份。

圖1 50 份棗種質(zhì)果實(shí)中黃酮含量的分布情況Fig.1 Distribution of flavonoid contents in jujube germplasm fruits

2.2 抗氧化能力分析

分別采用FRAP法、DPPH 法、ABTS 法這3 種評(píng)價(jià)方法測(cè)定了不同棗種質(zhì)果實(shí)黃酮提取液的抗氧化能力，結(jié)果見表2。表2表明，不同棗種質(zhì)果實(shí)黃酮提取液均有不同程度的抗氧化活性。以FRAP 評(píng)價(jià)法測(cè)得的50 份棗種質(zhì)果實(shí)黃酮提取液的抗氧化能力為2.83 ～18.44 g·kg-1，其均值為6.39 g·kg-1，其變幅為15.61，變異系數(shù)為44.77%。以DPPH 自由基清除能力評(píng)價(jià)法測(cè)得的50 份棗種質(zhì)果實(shí)黃酮提取液的抗氧化能力為1.02 ～2.82 mmol·g-1，其 均 值 為1.70 mmol·g-1，其變幅為1.80，變異系數(shù)為23.53%。以ABTS 自由基清除能力評(píng)價(jià)法測(cè)得的50 份棗種質(zhì)果實(shí)黃酮提取液的抗氧化能力為3.42 ～5.98 mmol·g-1，其均值為4.38 mmol·g-1，其變幅為2.56，變異系數(shù)為14.02%。采用3 種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法測(cè)定的結(jié)果均表明，果實(shí)黃酮提取液抗氧化活性較強(qiáng)的棗種質(zhì)分別為北京老虎眼、溆浦圓酸棗、獻(xiàn)縣酸棗、北京雞蛋棗、算盤棗、義烏棉絮棗等。

2.3 相關(guān)性分析

對(duì)50 份棗種質(zhì)果實(shí)中的黃酮含量與分別以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法這3 種抗氧化能力評(píng)價(jià)方法測(cè)得的黃酮提取液的抗氧化能力間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果見表3。表3表明，分別以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法這3 種抗氧化能力評(píng)價(jià)方法測(cè)得的黃酮提取液的抗氧化能力與棗果實(shí)中的黃酮含量間均呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.916、0.827、0.659。分別以FRAP 法、DPPH 法和ABTS 法評(píng)價(jià)得出的棗種質(zhì)果實(shí)黃酮提取液的抗氧化能力間也呈極顯著正相關(guān)，其中，F(xiàn)RAP 和DPPH、FRAP 和ABTS、DPPH 和ABTS間的相關(guān)系數(shù)分別為0.799、0.753、0.573。

2.4 聚類分析

以50 份棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)中的黃酮含量為依據(jù)，采用系統(tǒng)聚類（Hierarchical clustering）中的Ward 法，以Euclidean 距離為遺傳距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。在遺傳距離為10.0 處可將供試棗種質(zhì)分為3 大類。第1 類包含北京老虎眼、溆浦圓酸棗、獻(xiàn)縣酸棗、算盤棗、北京雞蛋棗、北京酸棗等6 份種質(zhì)，其黃酮含量≥10.00 mg·g-1，此類種質(zhì)數(shù)占供試種質(zhì)總數(shù)的12.00%，可將此類種質(zhì)定義為高黃酮含量類群，該類群主要為一些酸棗資源。第2 類包含義烏棉絮棗、大柿餅棗、早紅蜜、黃驊冬棗、臨猗梨棗等種質(zhì)，此類種質(zhì)共有18 份，5.00 mg·g-1≤黃酮含量＜10.00 mg·g-1，此類種質(zhì)數(shù)占供試種質(zhì)總數(shù)的36.00%，可將此類種質(zhì)定義為中等黃酮含量類群。其余26 份種質(zhì)都聚到第3類中，包括樂陵小棗、郎家園棗、保德油棗、棗強(qiáng)婆棗、夏津大白鈴等種質(zhì)，此類種質(zhì)數(shù)占供試種質(zhì)總數(shù)的52.00%，其黃酮含量＜5 mg·g-1，可將此類種質(zhì)定義為低黃酮含量類群。這一聚類分析結(jié)果可為今后有關(guān)棗種質(zhì)果實(shí)中黃酮類物質(zhì)的研究與利用提供參考依據(jù)。

表2 50 份棗種質(zhì)果實(shí)黃酮提取液的抗氧化能力Table2 Antioxidant capacity of fruits in 50 Chinese jujube germplasms

表3 棗種質(zhì)資源果實(shí)中黃酮含量與抗氧化能力的相關(guān)性?Table3 Correlation of flavonoid content and antioxidant capacity in Chinese jujube fruits

3 結(jié)論與討論

黃酮類物質(zhì)是棗果實(shí)中的重要功能性營(yíng)養(yǎng)成分之一，前人相關(guān)研究的供試品種主要是栽培品種，鮮有選用酸棗類、觀賞棗等不同類型種質(zhì)來(lái)系統(tǒng)評(píng)價(jià)棗果實(shí)中黃酮的含量及抗氧化活性的研究報(bào)道。趙愛玲等[14,20]測(cè)定了50 個(gè)棗品種果皮中的黃酮含量，結(jié)果得出，棗果皮的黃酮含量高于棗果肉的黃酮含量。成熟果實(shí)是棗樹的主要利用部位[21]，本試驗(yàn)研究了50 份具有代表性的棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)中的黃酮含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棗種質(zhì)果實(shí)中黃酮含量的分布范圍較為廣泛，不同種質(zhì)間其含量差異明顯，這與姜帆等[22]對(duì)枇杷花中黃酮含量的研究結(jié)果一致。以50 份棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)中的黃酮含量為依據(jù)進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果表明，果實(shí)中黃酮含量高的種質(zhì)大多為酸棗資源，黃酮含量中等和較低的種質(zhì)大多為栽培品種。因此，開發(fā)黃酮功能產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)選擇含量較高的種質(zhì)果實(shí)為原料。棗和酸棗是棗屬植物中最重要的兩個(gè)種，棗較酸棗進(jìn)化[23]，酸棗資源果實(shí)中黃酮含量高的原因可能是，其在進(jìn)化為棗的過程中次生代謝物的代謝途徑發(fā)生了變化。前人研究結(jié)果表明，黃酮類物質(zhì)含量與抗逆性有關(guān)[24]。酸棗長(zhǎng)期處于野生狀態(tài)中，其抗逆性較棗更強(qiáng)，這可能與其黃酮含量較高密切相關(guān)。黃酮含量受多種因素的影響[25]，是由遺傳因素和環(huán)境條件共同決定的。關(guān)于棗種質(zhì)黃酮類物質(zhì)的代謝機(jī)理尚需從分子水平上進(jìn)行深入研究。

圖2 50 份棗種質(zhì)果實(shí)黃酮含量的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of flavonoid contents of 50 jujube fruits

已有研究結(jié)果表明，黃酮類物質(zhì)具有抗氧化活性，能有效清除自由基[26]。棗果的“藥食同源”保健功能越來(lái)越受到人們的重視，這與其抗氧化活性等天然生物活性密不可分。本研究采用目前最常用的FRAP 法、DPPH 法、ABTS 法等3 種評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法，分析了50 份具有代表性的棗種質(zhì)脆熟期果實(shí)黃酮提取液的抗氧化活性，結(jié)果表明，棗種質(zhì)果實(shí)黃酮提取液均有一定的抗氧化活性，其果實(shí)黃酮含量與以此3 種評(píng)價(jià)方法測(cè)定的抗氧化能力間均呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明這3 種方法在評(píng)價(jià)抗氧化能力方面具有協(xié)同性與相似性，也進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)果的可靠性，這與其他果樹（如李[27]、核桃[28]等）的研究結(jié)果一致。據(jù)此可根據(jù)黃酮含量的高低初步判定種質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱。

本研究初步建立了棗種質(zhì)黃酮含量的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（高含量、中等含量、低含量），篩選出黃酮含量高且抗氧化活性強(qiáng)的棗種質(zhì)12 份，其分別為酸棗種質(zhì)4 份（北京老虎眼、溆浦圓酸棗、獻(xiàn)縣酸棗、北京酸棗）、觀賞種質(zhì)2 份（算盤棗、大柿餅棗）和栽培棗種質(zhì)6 份（北京雞蛋棗、義烏棉絮棗、早紅蜜、黃驊冬棗、臨猗梨棗和新疆小圓棗）。棗果中黃酮類物質(zhì)的組分有多種，不同組分發(fā)揮著不同的生理功能，測(cè)定總黃酮含量及抗氧化活性，可初步了解不同種質(zhì)棗果中黃酮含量的分布情況。今后可進(jìn)一步采用液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)[29]鑒定棗果中黃酮類物質(zhì)的組分，深入研究各組分的主要生理功能，并采用轉(zhuǎn)錄組、代謝組學(xué)等分子生物學(xué)手段研究其代謝途徑和調(diào)控機(jī)理，從而為高黃酮含量棗種質(zhì)的創(chuàng)制和黃酮功能產(chǎn)品開發(fā)時(shí)原料的選擇及種質(zhì)資源的綜合開發(fā)與利用提供理論參考依據(jù)。