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（1.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037；2.青海省海西蒙古族藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，青海 海西 817000）

枸杞Lycium barbarumL.是茄科Solanaceae 枸杞屬LyciumL.多年生落葉灌木，主要分布在青海、新疆、寧夏、甘肅等省區(qū)[1]。枸杞十分抗旱、耐鹽，多生長(zhǎng)在鹽堿地和荒漠中，對(duì)惡劣的條件有很強(qiáng)的適應(yīng)性[2]。枸杞果實(shí)含有大量的花青素[3-4]、多糖[5-7]、酚酸[8-9]等次生代謝物質(zhì)，具有較高的藥用價(jià)值，長(zhǎng)期食用能預(yù)防多種疾病，所以目前有關(guān)枸杞果實(shí)次生代謝物的研究報(bào)道較多。然而，在長(zhǎng)期的人工選育過(guò)程中，枸杞的基因型高度雜合，遺傳背景變得十分復(fù)雜[10]，因此，許多研究學(xué)者開(kāi)始從分子生物學(xué)的角度對(duì)枸杞種質(zhì)資源的遺傳多樣性展開(kāi)研究。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究者利用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)（如ISSR[11-12]、SCoT[13]、AFLP[14-15]、RAPD[16]、SSR[17-19]、SRAP[20]等）對(duì)枸杞種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。

SSR 標(biāo)記是依據(jù)生物基因組中1 ～6 個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)的DNA 序列特性開(kāi)發(fā)的一種分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析等[21-26]方面。但是，由于缺乏基因組信息，基于基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的傳統(tǒng)方法成本高，步驟復(fù)雜[27]，SSR 在枸杞種質(zhì)資源的研究中受到極大的限制。近年來(lái)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)多態(tài)性SSR 分子標(biāo)記的植物研究有許多報(bào)道：姚俊修等[28]利用西洋接骨木的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了25 對(duì)具有多態(tài)性的熒光SSR 分子標(biāo)記，并對(duì)8 個(gè)不同種的接骨木進(jìn)行了遺傳多樣性分析；黃海燕等[29]通過(guò)分析杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了20 對(duì)具有高多態(tài)性的EST-SSR 引物，其研究結(jié)果表明，利用以植物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的相關(guān)SSR 引物進(jìn)行植物遺傳多樣性研究是可行的；Chen 等[30]分析了黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組信息并進(jìn)行了SSR 分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，還利用所開(kāi)發(fā)的SSR 標(biāo)記將9 個(gè)不同群體的野生黑果枸杞分為3 組；尹躍等[31]利用黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組信息開(kāi)發(fā)了28 對(duì)高多態(tài)性引物，并對(duì)24 份枸杞的種質(zhì)進(jìn)行了區(qū)分，其研究結(jié)果表明，黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組信息可以作為開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的有效來(lái)源信息。

目前，有關(guān)不同地域黑果枸杞遺傳多樣性的研究報(bào)道較少。因此，本研究以美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）公布的黑果枸杞果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，挖掘轉(zhuǎn)錄因子SSR 引物，分析不同地理種源的黑果枸杞和不同栽培種的紅果枸杞的遺傳多樣性，在分子水平上為黑果枸杞新品種的鑒定和保護(hù)提供準(zhǔn)確、客觀和公正的判定條件，同時(shí)印證了以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)黑果枸杞SSR 標(biāo)記的可行性，以期為黑果枸杞的種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)和遺傳多樣性分析提供有意義的參考標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的30 份枸杞材料由兩部分構(gòu)成：一部分為青海省海西蒙古族藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所枸杞院士工作站枸杞種質(zhì)資源圃中保存的25 份枸杞材料，其中5 份為黑果枸杞，1 份為黃果枸杞，19份為紅果枸杞；另一部分為2018年7月在新疆維吾爾自治區(qū)和甘肅省等省區(qū)野外采集的5 份野生黑果枸杞。供試的30 份枸杞材料的基本情況見(jiàn)表1。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 的提取

利用Magen 植物組織DNA 提取試劑盒提取枸杞葉片總DNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 純度，用Nanodrop 核酸蛋白分析儀檢測(cè)其濃度，然后將其稀釋為50 ng·μL-1并保存于-20 ℃的冰箱中以備用。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理及引物設(shè)計(jì)

從NCBI的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為SRR2344923。將下載到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過(guò)Trinity 組裝軟件進(jìn)行序列組裝，然后利用MicroSAtellite（MISA http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）工具搜索Unigene 序列的SSR位點(diǎn)，參照尹躍等人[31]所用的方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行搜索。采用Primer Premier 3.0 軟件對(duì)含有SSR 位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)引物[28]，引物設(shè)計(jì)參數(shù)為：引物長(zhǎng)度為18 ～27 bp，GC 為40%～60%，退火溫度為50 ～60 ℃，PCR 擴(kuò)增長(zhǎng)度為100 ～300 bp，其他參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值。

表1 30 份枸杞材料的基本信息Table1 The information of 30 L.barbarum

1.2.3 引物的篩選

引物由南京擎科生物技術(shù)公司合成，PCR反應(yīng)所需的2×Taq PCR MasterMix 及DNA marker均購(gòu)買于擎科生物（南京）有限公司。從供試材料中選取植物表型性狀差異較大的6 份樣品的DNA 模板對(duì)116 對(duì)引物進(jìn)行篩選，最終選擇條帶清晰、穩(wěn)定性和多態(tài)性均好且對(duì)6 份樣品均有較好鑒別力的20 對(duì)引物用于所有樣品的PCR 擴(kuò)增，20 對(duì)引物的序列信息見(jiàn)表2。

1.2.4 SSR-PCR 反應(yīng)體系

采用15 μL 的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL (50 ng·L-1)，2×Taq PCR Master Mix（含有Taq 酶、dNTP 和緩沖液）8 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol·L-1），去離子水15 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，預(yù)變性4 min；94 ℃，變性30 s；退火溫度56 ～60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃，延伸10 min，于4 ℃條件下保存。

1.2.5 PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)

先用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)特異性位點(diǎn)，對(duì)有特異性位點(diǎn)的樣品，再用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳后用熒光染料染色，用生物電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照。

表2 SSR 引物序列信息Table2 The information of SSR primer sequences used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件統(tǒng)計(jì)電泳圖中的譜帶，按照擴(kuò)增條帶分子量的大小在相同遷移位置讀取，有條帶的記為1，無(wú)條帶的或無(wú)法辨別的帶型記為0，構(gòu)建“0,1”矩陣。利用Popgene 32 軟件計(jì)算Nei’s的遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon 信息指數(shù)（I）、擴(kuò)增總條帶數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）等遺傳參數(shù)[32]，使用PIC_calc 0.6 軟件計(jì)算各引物位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）。利用NTSYS-pc 軟件計(jì)算品種間遺傳相似系數(shù)（GS），并按UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析[13]，采用GraphPad Prism 8 軟件優(yōu)化遺傳相似系數(shù)矩陣，構(gòu)建30 個(gè)枸杞品種的聚類樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果分析

擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。表3表明：用篩選出的20 對(duì)SSR 引物分別對(duì)30 個(gè)枸杞品種進(jìn)行SSRPCR 擴(kuò)增，從20 對(duì)SSR 引物中共擴(kuò)增出121 條條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增6.05 條，擴(kuò)增出的條帶數(shù)大多為2 ～8 條。不同引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)量差異較大，其中擴(kuò)增條帶最多的引物為P1-5，其條帶為16 條，擴(kuò)增條帶最少的引物為P3-26，其條帶為2條。引物P1-5的部分?jǐn)U增結(jié)果如圖1所示。30 份枸杞材料的有效等位基因數(shù)（Ne）的變化范圍為1.201 6 ～1.682 8 個(gè)，其均值為1.473 1 個(gè)；Nei’s 多樣性指數(shù)（H）的變化范圍為0.150 3 ～0.391 5，平均值為0.291 7；Shannon 信息指數(shù)（I）的變化范圍為0.265 4 ～0.576 5，平均值為0.451 7；多態(tài)信息量（PIC）范圍為0.325 ～0.898，平均值為0.667。一般認(rèn)為，當(dāng)PIC ＜0.25 時(shí)，該引物為低度多態(tài)性信息引物；當(dāng)PIC ＞0.50 時(shí)，該引物則為高度多態(tài)性信息引物[33]。因此，所選引物大部分為高度多態(tài)性信息引物，說(shuō)明這些引物均可用于枸杞種質(zhì)資源的鑒定和研究。

2.2 遺傳相似性與聚類分析

采用Excel 軟件將30 份枸杞樣品與122 個(gè)位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)為原始矩陣，再以NTSYS-pc 2.1 軟件計(jì)算30 份枸杞材料間的遺傳相似系數(shù)（GS），計(jì)算結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，任意兩份材料之間的相似系數(shù)為0.459 2 ～0.991 8，其平均GS 值為0.725 5。

基于30 份枸杞材料的遺傳相似系數(shù)，用UPGMA 法對(duì)其進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在遺傳相似系數(shù)0.62 處，30 份枸杞材料可聚為如下6 個(gè)組。第I組包括10 份黑果枸杞，青海（H1、H2、H3、H4、H5、H6）、新疆（H7、H8、H9）、甘肅（H10）的黑果枸杞聚為一類，青海和新疆的黑果枸杞的遺傳距離較近，而與甘肅黑果枸杞的遺傳距離較遠(yuǎn)。第Ⅱ組有紫果枸杞（R13）、黃果枸杞（R14）和水果枸杞（R15）共3 份材料；紫果枸杞可能由于在培育雜交新品種研究中以黑果枸杞為親本，導(dǎo)致其基因和本身性狀都趨近于黑果枸杞；黃果枸杞與水果枸杞聚為一類，說(shuō)明青海當(dāng)?shù)卦耘嗟乃坭脚c黃果枸杞的親緣關(guān)系較近，這與其研究所用親本的遺傳關(guān)系相近有關(guān)。第Ⅲ組包括抗旱優(yōu)良品種與花用枸杞和多果類枸杞。第Ⅳ組所聚品種數(shù)最多，占試驗(yàn)材料的36.7%；其中，柴杞1號(hào)（R2）和柴杞3號(hào)（R3）、柴杞2號(hào)（R4）和高產(chǎn)抗病型（R6）、茶用枸杞（R9）和R12 之間均表現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系，它們均來(lái)自于青海省德令哈市尕海鎮(zhèn)的枸杞良種繁育基地，其親本來(lái)源種質(zhì)成分可能有一定的相似性；被聚在一類的R11、R18、R19 均為新培育的植株材料，說(shuō)明它們具有相似的遺傳背景。第Ⅴ組包括菜用枸杞（R1）與葉用枸杞（R8）。第Ⅵ組為發(fā)現(xiàn)于青海省德令哈市尕海鎮(zhèn)的野生紅枸杞。第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組內(nèi)的栽培枸杞的遺傳相似系數(shù)均較高，說(shuō)明其遺傳距離越近，親緣關(guān)系也就越近。這可能由于枸杞種質(zhì)資源比較豐富且栽培歷史悠久，屬內(nèi)種間（滲透）雜交現(xiàn)象普遍，加之地方品種本身無(wú)科學(xué)命名，導(dǎo)致品種資源類型多且名稱混亂[34]。

表3 供試枸杞材料遺傳多樣性的擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table3 The statistics of genetic diversity of L.barbarum

圖1 引物P1-5 對(duì)30 份枸杞材料的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.1 Amplified 30 samples results partly by primers P1-5

圖2 供試的30 份枸杞材料的遺傳相似系數(shù)Fig.2 Genetic similarity coefficient of 30 samples of L.barbarum

圖3 供試的30 份枸杞材料的聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis results of 30 samples of L.barbarum

3 結(jié)論與討論

分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各類物種遺傳資源的研究中，關(guān)于利用不同分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)枸杞的遺傳多樣性與親緣關(guān)系的研究報(bào)道較多[11,13,16-17,20]。本研究利用黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)出枸杞SSR引物，對(duì)10 份不同地域的黑果枸杞及20 份不同栽培型的紅果枸杞進(jìn)行了分子標(biāo)記分析。從182對(duì)引物中共篩選出20 對(duì)多態(tài)性SSR 引物。對(duì)青海、新疆、甘肅這3 個(gè)省區(qū)的10 份黑果枸杞、20 份栽培紅枸杞品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，計(jì)算出了不同材料間的遺傳距離，明確了30 份材料間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，研究結(jié)果表明，基于黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的引物可以用于枸杞品種的鑒別，20 對(duì)引物的多態(tài)性信息量豐富，平均為0.667，這一結(jié)果稍低于尹躍等[31]的研究結(jié)果；其次，將10 份黑果枸杞再作聚類分析，青海、新疆、甘肅的黑果枸杞被區(qū)分開(kāi)來(lái)，這一結(jié)果與Chen 等[30]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明以黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的SSR 分子標(biāo)記可以從分子水平上鑒別黑果枸杞品種的差異；尤其是H1 和H2、H4 和H6 之間的遺傳相似系數(shù)均高達(dá)0.991，這充分說(shuō)明了基于黑果枸杞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的SSR 引物能有效地鑒別黑果枸杞的品種差異。此結(jié)果也印證了Ono等[35]的“用石榴皮轉(zhuǎn)錄組信息開(kāi)發(fā)了SSR 分子標(biāo)記，并且可以有效地對(duì)石榴品種進(jìn)行鑒別，說(shuō)明了從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中開(kāi)發(fā)SSR 分子標(biāo)記的可靠性”這一研究結(jié)果。本研究篩選出的20 對(duì)SSR 引物，可以用于黑果枸杞品種鑒定和黑果枸杞分子輔助遺傳育種等方面的研究之中。

本研究所用材料主要來(lái)源于青海省德令哈市尕海鎮(zhèn)枸杞良種繁育基地，但是，研究中出現(xiàn)了聚類分析結(jié)果與品種來(lái)源信息不相符的情況，如黃果枸杞、水果枸杞與黑果枸杞的遺傳距離相對(duì)較近，但其性狀卻存在很大的不同，其原因可能是，所用引物數(shù)量有限，擴(kuò)增的多態(tài)性條帶較少，不能充分表現(xiàn)材料本身的特異性，因此需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)黑果枸杞的SSR 引物。傳統(tǒng)SSR 分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)所需費(fèi)用高，而通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR 引物，不僅可以開(kāi)發(fā)出針對(duì)表型的特異性SSR 引物，而且所開(kāi)發(fā)出的引物還具有種屬間良好的通用性，還可省時(shí)省力，節(jié)約成本。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)并篩選出多態(tài)性較好的20 對(duì)SSR 引物，不僅可應(yīng)用于分析現(xiàn)有枸杞屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性，還可以應(yīng)用于黑果枸杞種質(zhì)的遺傳多樣性分析。由于目前收集到的黑果枸杞種質(zhì)資源相對(duì)較少，本研究?jī)H對(duì)目前青海省德令哈市枸杞良種繁育基地中收集、保存的黑果枸杞進(jìn)行了評(píng)價(jià)，所用的引物僅來(lái)自于黑果枸杞果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的一部分，因此應(yīng)開(kāi)發(fā)和挖掘更多的SSR 引物進(jìn)行綜合深入的評(píng)價(jià)分析。在今后的黑果枸杞研究工作中，還應(yīng)收集國(guó)外的黑果枸杞種質(zhì)資源，挖掘國(guó)內(nèi)枸杞屬野生種質(zhì)資源，進(jìn)一步豐富黑果枸杞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；開(kāi)發(fā)新的SSR 引物，豐富現(xiàn)有引物數(shù)據(jù)；利用分子輔助育種方法創(chuàng)新研究黑果枸杞種質(zhì)資源。