，，，，，，，

（1.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510507；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院；b.廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642；3.中國科學(xué)院華南植物園，廣東 廣州 510650；4.佛山科技學(xué)院，廣東 佛山 528231）

光合作用是植物維持生命的最基本活動，是其對干旱脅迫響應(yīng)最敏感的生理過程之一[1]。干旱脅迫能破壞植物的水分代謝，導(dǎo)致葉綠素分解，影響光能電子傳遞和轉(zhuǎn)換、光合磷酸化及暗反應(yīng)等一系列過程，使得植物光合速率下降，嚴重時還可導(dǎo)致葉綠體光合機構(gòu)的破壞[2]，對植物體造成不可逆影響。葉綠素?zé)晒鈪?shù)對干旱脅迫的響應(yīng)非常靈敏[3]，能夠作為干旱脅迫監(jiān)測的內(nèi)在敏感指標(biāo)，密切監(jiān)測光合作用過程中光能的吸收、傳遞、耗散和分配[4]。目前，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)已成為檢測植物耐干旱脅迫能力的有效手段，并在黑麥草Lolium perenne[5]、金銀花Lonicera japonica[6]、番茄Solanum lycopersicum[7]、黑果枸杞Lycium ruthenicum[8]和栓皮槭Acer campestre[9]等植物的耐干旱脅迫研究中得以應(yīng)用。

油茶Camellia oleifera是中國特有的耐干旱、耐貧瘠木本油料經(jīng)濟作物，現(xiàn)已選育出眾多優(yōu)良品種，但各品種的抗旱性存在差異[10]。當(dāng)前，針對油茶抗旱性的研究主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)[11]、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[12]、保護酶系統(tǒng)[13]、內(nèi)源激素[14]、光合參數(shù)[15]和轉(zhuǎn)錄組[16]等方面，針對油茶葉綠素?zé)晒獾难芯恐饕性诟髌贩N的基本熒光特性[17]、營養(yǎng)元素吸收[18]及外源激素響應(yīng)[19]等方面。應(yīng)用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)開展油茶抗旱性研究的報道較為鮮見，僅見刁兆龍[20]報道了干旱脅迫下1年生‘閩43’油茶苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化規(guī)律，及油茶對干旱脅迫的響應(yīng)。本研究中借助葉綠素?zé)晒鈾z測技術(shù)，探討干旱脅迫和復(fù)水后廣西4 個油茶優(yōu)良品種葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化規(guī)律，并采用隸屬函數(shù)法和聚類分析法綜合評價其抗旱能力，以期篩選出高光效抗旱油茶種質(zhì)，為后續(xù)油茶耐旱品種選育和引種栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試苗木

以華南地區(qū)廣泛栽培的岑軟2號、岑軟3號、桂無1號和桂無4號1年生油茶嫁接苗為試驗材料。所有苗木均產(chǎn)自廣東農(nóng)墾熱帶作物科學(xué)研究所，引回后統(tǒng)一培育在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟林研究中心苗圃。將苗木移植入育苗袋（12 cm×8 cm）中，6 個月后挑選生長一致的健壯植株進行試驗。幼苗情況詳見表1。

1.2 試驗設(shè)計

干旱脅迫及復(fù)水處理均在人工氣候室（BIC-250）內(nèi)進行。光照強度調(diào)控在2 500 lx，給予光照14 h 和黑暗10 h 的光周期，溫度控制在（25±2）℃，濕度控制在75%～85%。將根部土壤洗凈，固定在3 個裝有新鮮1/2 Hoagland 營養(yǎng)液的培養(yǎng)槽中緩苗2 d。隨后，將5 L 新鮮1/2 Hoagland 營養(yǎng)液和不同量PEG 6000 配制的處理液倒入培養(yǎng)槽進行干旱脅迫處理。

表1 供試油茶幼苗基本生長情況Table1 Basic characteristics of tested seedlings in C.oleifera cm

共設(shè)置3 個脅迫強度，分別為100 g/L PEG 6000（輕度脅迫）、200 g/L PEG 6000（中度脅迫）和300 g/L PEG 6000（重度脅迫），以不添加PEG 6000 為對照。每個脅迫處理設(shè)4 個時間點，包括12、24、36 h，以及36 h 后將脅迫處理液置換成5 L 的1/2 Hoagland 營養(yǎng)液進行復(fù)水12 h 處理。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 葉綠素含量的測定

采用分光光度法測定葉綠素a 和葉綠素b 的含量。將油茶葉去掉中脈后剪碎混合，稱量0.5 g碎樣放入干燥研缽，加入液氮快速研磨至粉末。先后加入2 和5 mL 80%的丙酮，繼續(xù)研磨成勻漿狀后靜置3 min，將勻漿全部轉(zhuǎn)入25 mL 棕色容量瓶，并用80%丙酮定容，充分搖勻靜置24 h。將提取液倒入管徑為10 mm 的比色皿，以80%丙酮為空白對照。將分光光度計的波長設(shè)置為645 和663 nm，分別測定其吸光值。將所測吸光值代入以下公式計算葉綠素含量。

式中：Ca表示葉綠素a 含量；Cb表示葉綠素b 含量；D663表示波長663 nm 處的吸光值；D645表示波長645 nm 處的吸光值。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

采用脈沖調(diào)制熒光儀OS-1P（OPTI，USA）測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。每個處理隨機挑選5 株健壯植株，在每株第4 ～6 枚功能葉間隨機選定1枚生長成熟、長勢良好、無病蟲害的葉片掛牌標(biāo)記，進行在體測試。經(jīng)過充分光適應(yīng)后，在暗處進行20 min 暗適應(yīng)，選擇非光化學(xué)淬滅（NPQ）模式，測定PS Ⅱ非調(diào)節(jié)性能量耗散（YNO）、PS Ⅱ調(diào)節(jié)性能量耗散（YNPQ）、非光化學(xué)淬滅（NPQ）。每次測定時間為1 min，每枚葉片進行3 次葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定，取平均值。計算表觀電子傳遞速率（ETR）和實際光量子效率（YPSⅡ）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2016 和SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析和圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對油茶葉片葉綠素含量的影響

2.1.1 對油茶葉片葉綠素a 含量的影響

干旱脅迫對各品種油茶葉片葉綠素a 含量的影響如圖1所示。由圖1可見，桂無4號葉片葉綠素a 含量隨干旱脅迫時間延長而持續(xù)下降，其余3 個品種葉片葉綠素a 含量波動較小。干旱脅迫36 h 時，僅桂無4號葉片葉綠素a 含量顯著低于對照（P＜0.05），其余品種所有處理與對照間差異性不顯著或顯著高于對照。在脅迫過程中，岑軟2號葉片葉綠素a 含量較其余3 個品種高，表明在同等脅迫條件下岑然2號葉片能維持更高的葉綠素a 含量。復(fù)水處理后，除桂無1號輕度脅迫處理中葉片葉綠素a 含量小幅升高，其余處理均降低。

2.1.2 對油茶葉片葉綠素b 含量的影響

干旱脅迫對各品種油茶葉片葉綠素b 含量的影響如圖2所示。由圖2可見，干旱脅迫初期（脅迫0、12、24 h），桂無1號和桂無4號葉片葉綠素b 含量高于岑軟2號和岑軟3號。干旱脅迫36 h時，桂無1號和桂無4號葉片葉綠素b 含量快速降低，且顯著低于對照（P＜0.05）。在整個試驗過程中，岑軟2號和岑軟3號葉片葉綠素b 含量穩(wěn)定，各強度干旱脅迫36 h 時的葉綠素b 含量均高于對照。復(fù)水后，岑軟2號和岑軟3號葉片葉綠素b 含量顯著降低（P＜0.05），桂無1號和桂無4號葉片葉綠素b 含量變化不顯著。

2.2 干旱脅迫對油茶葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.2.1 對油茶葉片ETR 的影響

干旱脅迫對各品種油茶葉片ETR 的影響如圖3所示。由圖3可見，受干旱脅迫影響，桂無1號和桂無4號葉片ETR 逐步下降，且降幅明顯。岑軟2號和岑軟3號葉片ETR 在脅迫持續(xù)12 h時降低，脅迫持續(xù)24 h 時達峰值，脅迫持續(xù)36 h時又顯著下降，呈波動變化，但始終維持在較大值，而且在脅迫后期明顯高于桂無1號和桂無4號。復(fù)水處理12 h 時，除在輕度脅迫處理中岑軟2號和岑軟3號葉片ETR 恢復(fù)至對照水平，其余處理ETR 仍然顯著低于對照（P＜0.05），與對照的ETR 差值隨脅迫增強而增大。

圖1 干旱脅迫對油茶葉片葉綠素a 含量的影響Fig.1 Effect of drought stress on chlorophyll a content

圖2 干旱脅迫對各品種油茶葉片葉綠素b 含量的影響Fig.2 Effect of drought stress on chlorophyll b content

2.2.2 對油茶葉片YPS Ⅱ的影響

干旱脅迫對各品種油茶葉片YPSⅡ的影響如圖4所示。由圖4可見，4 個油茶品種葉片YPSⅡ變化幅度隨脅迫的增強而增大，岑軟系列2 個品種YPSⅡ均較桂無系列2 個品種大。干旱脅迫導(dǎo)致桂無1號和桂無4號葉片YPSⅡ隨脅迫時間延長而逐漸下降，且降幅明顯。岑軟2號和岑軟3號葉片YPSⅡ呈現(xiàn)“降低—升高—降低”的波動變化趨勢。復(fù)水后，輕度脅迫處理中岑軟2號葉片YPSⅡ顯著升高，重度脅迫處理中岑軟3號和輕度脅迫處理中桂無4號葉片YPSⅡ顯著下降（P＜0.05），其余各處理差異不顯著。

圖3 干旱脅迫對各品種油茶葉片表觀電子傳遞速率（ETR）的影響Fig.3 Effect of drought stress on electron transport rate (ETR)

圖4 干旱脅迫對各品種油茶葉片實際光量子效率（YPS Ⅱ）的影響Fig.4 Effect of drought stress on active quantum efficiency of PS Ⅱ (YPS Ⅱ)

2.2.3 對油茶葉片NPQ 的影響

干旱脅迫對各品種油茶葉片NPQ 的影響如圖5所示。由圖5可見，在試驗過程中，岑軟2號和岑軟3號的NPQ 增幅較桂無1號和桂無4號大。脅迫初期（脅迫0、12、24 h），各脅迫強度下桂無1號葉片NPQ 持續(xù)下降，桂無4號葉片NPQ 波動變化，脅迫持續(xù)36 h 時桂無系列2 個品種葉片NPQ 均升高，其中輕度脅迫和中度脅迫處理下葉片NPQ 顯著高于對照，重度脅迫處理下顯著低于對照。岑軟2號和岑軟3號葉片NPQ隨脅迫時間的延長而顯著升高，所有處理在脅迫持續(xù)24 h 時葉片NPQ 均達到峰值，脅迫持續(xù)36 h時顯著下降（P＜0.05）。復(fù)水12 h 時，輕度脅迫處理下桂無1號和桂無4號葉片NPQ 顯著降低（P＜0.05），其余處理差異不顯著。

2.2.4 對油茶葉片YNPQ 的影響

干旱脅迫對各品種油茶葉片YNPQ的影響如圖6所示。由圖6可見，干旱脅迫持續(xù)12 和24 h時，桂無1號葉片YNPQ持續(xù)下降，輕度脅迫持續(xù)36 h 時葉片YNPQ顯著高于對照（P＜0.05），而中度脅迫和重度脅迫處理下葉片YNPQ與對照差異不顯著。各處理中，隨脅迫時間延長，桂無4號葉片YNPQ呈現(xiàn)“升高—降低—升高”的波動變化，輕度脅迫和中度脅迫持續(xù)36 h 時葉片YNPQ顯著高于對照（P＜0.05），重度脅迫處理下葉片YNPQ與對照差異不顯著；岑軟2號和岑軟3號葉片YNPQ隨脅迫時間延長而增加，且于脅迫持續(xù)24 h 時達峰值，脅迫持續(xù)36 h 時顯著下降（P＜0.05）。復(fù)水處理12 h 時，除輕度脅迫和重度脅迫處理下桂無1號及輕度脅迫處理下岑軟2號葉片YNPQ顯著低于對照外，其余處理與對照差異不顯著。

圖5 干旱脅迫對各品種油茶葉片非光化學(xué)淬滅（NPQ）的影響Fig.5 Effect of drought stress on non-photochemical quenching (NPQ)

圖6 干旱脅迫對各品種油茶葉片PS Ⅱ調(diào)節(jié)性能量耗散（YNPQ）的影響Fig.6 Effect of drought stress on quantum yield of regulated energy dissipation (YNPQ)

2.2.5 干旱脅迫對油茶葉片YNO 的影響

干旱脅迫對各品種油茶葉片YNO的影響如圖7所示。由圖7可見，隨著干旱脅迫的持續(xù)，脅迫持續(xù)12、24 h 時岑軟2號和岑軟3號葉片YNO逐漸降低，桂無1號和桂無4號葉片YNO逐漸升高，這種變化趨勢導(dǎo)致脅迫初期岑軟2號和岑軟3號葉片YNO低于桂無1號和桂無4號。但是脅迫持續(xù)36 h 時，除重度脅迫處理下桂無1號、桂無4號和岑軟3號葉片的YNO值顯著高于對照（P＜0.05），其余處理與對照差異不顯著。復(fù)水12 h 時，輕度脅迫處理下桂無1號和桂無4號，及重度脅迫處理下岑軟3號葉片YNO顯著升高（P＜0.05），其余處理變化不顯著。

2.3 油茶抗旱性的綜合評價

2.3.1 隸屬函數(shù)分析

隸屬函數(shù)法能在多指標(biāo)基礎(chǔ)上反映植物的抗旱性[21]，能較為全面綜合地反映植物的真實抗旱能力。采用葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、表觀電子傳遞速率、實際光量子效率、非光化學(xué)淬滅、PS Ⅱ調(diào)節(jié)性能量耗散、PS Ⅱ非調(diào)節(jié)性能量耗散共7 個生理指標(biāo)進行油茶抗旱性隸屬函數(shù)分析。結(jié)果顯示（表2），4 個油茶品種按照其抗旱性由強到弱排序依次為岑軟2號、岑軟3號、桂無1號、桂無4號。

圖7 干旱脅迫對各品種油茶葉片PS Ⅱ非調(diào)節(jié)性能量耗散（YNO）的影響Fig.7 Effect of drought stress on quantum yield of non-regulated energy dissipation (YNO)

表2 干旱脅迫下4 個油茶品種葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的隸屬函數(shù)值及抗旱性排序Table2 The subordinate function values and anti-drought order of four cultivars under different drought intensity

2.3.2 聚類分析

基于4 個油茶品種的葉綠素a 含量、葉綠素b含量、表觀電子傳遞速率、實際光量子效率、非光化學(xué)淬滅、PS Ⅱ調(diào)節(jié)性能量耗散、PS Ⅱ非調(diào)節(jié)性能量耗散，采用歐氏距離法及系統(tǒng)聚類法對各生理指標(biāo)進行系統(tǒng)聚類（圖8）。結(jié)果顯示，4 個油茶品種可被劃分為2 大類群，其中桂無1號和桂無4號歸為一個類群，抗旱能力較弱；岑軟2號和岑軟3號歸為一個類群，抗旱能力較強。

圖8 基于抗旱性的各油茶品種聚類結(jié)果Fig.8 Drought resistance clustering analyses of different C.oleifera cultivars

3 結(jié)論與討論

本研究中對4 個油茶品種在不同強度干旱脅迫及復(fù)水處理處理下的葉綠素a 含量、葉綠素b含量、表觀電子傳遞速率（ETR）、實際光量子效率（YPSⅡ）、非光化學(xué)淬滅（NPQ）、PS Ⅱ調(diào)節(jié)性能量耗散（YNPQ）、PS Ⅱ非調(diào)節(jié)性能量耗散（YNO）共7 個指標(biāo)進行動態(tài)監(jiān)測，采用隸屬函數(shù)法和聚類分析法對其抗旱性進行綜合評價。結(jié)果顯示，岑軟2號和岑軟3號的抗旱性較強，屬耐旱品種；桂無1號和桂無4號抗旱性較弱，屬干旱敏感品種。4 個油茶品種按照其抗旱性由強到弱排序依次為岑軟2號、岑軟3號、桂無1號、桂無4號。

葉綠素a 和葉綠素b 是葉綠素的主要組成成分，是植物重要的光合色素[22]。葉綠素a 主要吸收長波光，葉綠素b 主要吸收短波光。干旱脅迫會導(dǎo)致植物葉片光合色素含量降低，影響植物對光能的正常吸收，影響后續(xù)光能的傳遞、耗散和分配，直接導(dǎo)致葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，破壞光合作用的正常進行。本研究中，在不同強度干旱脅迫下，岑軟2號和岑軟3號均能維持穩(wěn)定的葉綠素a 和葉綠素b 含量，表明其在干旱條件下具有較強的光能吸收能力，較能適應(yīng)脅迫環(huán)境；桂無4號葉片葉綠素a 和葉綠素b 含量，及桂無1號葉片葉綠素b 含量隨脅迫持續(xù)而顯著下降，表明干旱脅迫導(dǎo)致其光合色素分解，影響光合作用的正常進行。

ETR反映實際光強下的光合能量傳遞速率[23]，YPSⅡ反映光化學(xué)反應(yīng)消耗的能量比例，是植物實際光合效率的體現(xiàn)[24]，均是植物光合作用的正向指標(biāo)。桂無1號和桂無4號葉片ETR 和YPSⅡ隨干旱脅迫持續(xù)而顯著下降，表明干旱脅迫對其正常光合作用造成了明顯傷害。ETR 降低表明干旱脅迫引起了捕光天線和反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致PS Ⅱ電子傳遞受阻；YPSⅡ降低顯示干旱脅迫引起其實際光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率下降，降低了碳反應(yīng)中的CO2同化能力[25]，抑制了植物光呼吸及依賴O2的電子流[26]。在脅迫初期，岑軟2號和岑軟3號葉片的ETR 和YPSⅡ均降低，但在脅迫持續(xù)24 h 時快速升高且大部分處理顯著高于對照，表明這2 個品種能及時適應(yīng)干旱環(huán)境，維持正常的光合作用，以保證其生命代謝的正常進行[27-28]。此結(jié)果與李得祿等[29]對青海云杉Picea crassifolia和沙地云杉Picea mongolica，以及胡宏遠等[30]對赤霞珠葡萄Cabernet Sauvignon 的研究結(jié)果類似。在整個脅迫過程中，岑軟2號和岑軟3號葉片ETR 和YPSⅡ均能維持在較高水平，表明其抗旱性比桂無系列2 個品種強。

如果PS Ⅱ吸收的光能超過其吸收范圍，會造成植物光合系統(tǒng)的破壞。NPQ 和YNPQ是反映植物以熱形式耗散的不能用于光合電子傳遞的多余光能，多余光能的熱耗散是植物的重要保護形式[31-33]。在脅迫初期，岑軟系列2 個品種葉片NPQ 和YNPQ迅速增大且于脅迫持續(xù)24 h 時達到峰值，脅迫持續(xù)36 h 時其值顯著下降至對照水平，表明這2 個品種通過自身調(diào)節(jié)機制快速消耗過剩光能以保護光合系統(tǒng)[34]，適應(yīng)了干旱環(huán)境。在輕度脅迫和中度脅迫下，桂無1號和桂無4號葉片NPQ 和YNPQ在脅迫初期降低，脅迫持續(xù)36 h 時其值迅速增大且達到峰值，重度脅迫下葉片NPQ 和YNPQ隨脅迫持續(xù)而降低，表明桂無1號和桂無4號在輕度脅迫和中度脅迫條件下仍具有一定的熱耗散調(diào)節(jié)能力，但在重度脅迫條件下，已不能進行正常光能熱耗散，難以適應(yīng)脅迫環(huán)境。

YNO反映植物光合系統(tǒng)因光鈍化引起的非調(diào)節(jié)性量子產(chǎn)量，是光損傷的負評價指標(biāo)[35]。本研究中，桂無1號和桂無4號在脅迫持續(xù)12 和24 h 時葉片YNO持續(xù)增加，表明其在脅迫初期已達到光能消耗極限，積累的過剩光能可能傳遞給O2，形成破壞性極大的單線態(tài)氧（1O2），導(dǎo)致光合機構(gòu)失活。岑軟2號和岑軟3號葉片YNO在脅迫持續(xù)24 h 時顯著降低，且在整個試驗過程中各處理葉片YNO均未明顯高于對照，表明其在干旱脅迫下通過自身調(diào)節(jié)增強了光能消耗能力，有效保護了光合系統(tǒng)，更適應(yīng)干旱脅迫環(huán)境。

進行復(fù)水處理解除脅迫后，桂無1號和桂無4號葉片葉綠素a 和葉綠素b 含量這2 個光合色素指標(biāo)變化不顯著，ETR、YPSⅡ、YNO、NPQ 和YNPQ等葉綠素?zé)晒馍碇笜?biāo)無恢復(fù)跡象，表明桂無系列2 個品種的旱后恢復(fù)能力較弱，干旱脅迫初期已對其產(chǎn)生較大傷害。而岑軟2號和岑軟3號各指標(biāo)出現(xiàn)不同程度正向恢復(fù)，尤其是在輕度脅迫下，ETR、YPSⅡ、YNO、NPQ 和YNPQ等葉綠素?zé)晒馍碇笜?biāo)恢復(fù)至對照水平，表明其具有良好的旱后恢復(fù)能力，在脅迫解除后能快速恢復(fù)正常生長。

本研究中，4 個油茶品種葉片葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)均發(fā)生顯著變化，結(jié)果表明干旱脅迫有效引起了油茶的應(yīng)激生理反應(yīng)。但是，本研究中僅從油茶幼苗葉綠素和葉綠素?zé)晒馍韺用媪私庥筒鑼Ω珊得{迫的響應(yīng)機制，對于油茶抗旱機理的研究不夠全面，只有對更多油茶品種進一步開展生理生化指標(biāo)、光合生理指標(biāo)、植物解剖結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)等多方面的綜合研究，才能更深入全面地了解油茶的抗旱機理。