左琴華，薛 巍

（暨南大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系 生物材料廣東高校重點實驗室，廣東 廣州 510632）

細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，通過在體外模擬細(xì)胞在體內(nèi)的特定生長環(huán)境，使得單個或者細(xì)胞群能夠在體外生存、繁殖，維持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工程[1]、基因工程[2-3]和生物醫(yī)學(xué)工程[4-5]等研究領(lǐng)域，并且成為從事生物醫(yī)學(xué)工程研究領(lǐng)域的科研技術(shù)人員所必須掌握的一項技術(shù)。據(jù)統(tǒng)計，近幾年暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系80%以上研究生的課題研究均涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，體現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程研究領(lǐng)域的重要性[6-8]。

細(xì)胞培養(yǎng)室是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞相關(guān)研究活動的重要場所，是生物醫(yī)學(xué)工程研究領(lǐng)域科研產(chǎn)出的重要平臺。由于細(xì)胞培養(yǎng)要求無菌操作，因此細(xì)胞培養(yǎng)室的布局及維護(hù)管理也就有別于一般的實驗室[9]。建設(shè)并管理好提供儀器、技術(shù)服務(wù)的細(xì)胞培養(yǎng)實驗平臺，對于教學(xué)和科研的發(fā)展有著至關(guān)重要的作用[10-11]。本文對平臺建設(shè)和管理過程中，細(xì)胞培養(yǎng)室的布局、儀器管理、制度管理、人員及操作規(guī)范化管理進(jìn)行了探討，著重分析了新形勢下生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)研究生細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀、存在的問題及解決辦法，對人才培養(yǎng)及操作規(guī)范化管理進(jìn)行了較為深入的分析。

1 細(xì)胞培養(yǎng)實驗平臺的布局

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計原則

組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實驗技術(shù)的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響，便于隔離、操作、滅菌和觀察[7]。細(xì)胞培養(yǎng)室的總體設(shè)計原則是：細(xì)胞培養(yǎng)室與其他輔助實驗室必須分開；各實驗室之間要合理布局，便于實驗操作，盡量減少交叉干擾。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)室的布局

細(xì)胞培養(yǎng)室應(yīng)配備無菌操作設(shè)備、細(xì)胞孵育設(shè)備、細(xì)胞觀察設(shè)備、細(xì)胞凍存設(shè)備以及實驗用品的準(zhǔn)備、清洗、無菌處理等設(shè)備[12]。根據(jù)各類設(shè)備不同功能可將細(xì)胞培養(yǎng)室劃分為5 個功能區(qū)：無菌操作區(qū)、孵育區(qū)、制備區(qū)、儲藏區(qū)和洗涮消毒區(qū)。實驗室通常由2個房間組成，無菌實驗操作、觀察、孵育應(yīng)安排在同一空間; 而清洗、消毒等操作則安排在另一房間[13]。無菌操作區(qū)一般安排在實驗室內(nèi)側(cè)，洗涮滅菌區(qū)則設(shè)在無菌操作區(qū)的對面，準(zhǔn)備區(qū)和儲存區(qū)位于兩者之間。準(zhǔn)備區(qū)應(yīng)靠近洗涮滅菌區(qū)，儲存區(qū)靠近無菌操作區(qū)。生物醫(yī)學(xué)工程系細(xì)胞培養(yǎng)公共實驗平臺采用單房間細(xì)胞培養(yǎng)室布局設(shè)計，如圖1 所示。

圖1 單房間細(xì)胞培養(yǎng)室布局設(shè)計

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)室各區(qū)域作用及設(shè)計要求

（1）無菌操作區(qū)。主要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及無菌操作，理想的無菌操作室應(yīng)分為更衣間、緩沖間和無菌操作間三個部分。要求地面、天花板及四面墻壁光滑無死角以便清潔和消毒，內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)采用塑鋼板或瓷磚裝修；大小適度，層高不高于2.5 m，以保證紫外線的滅菌效果；配置紫外燈1～2 盞，保持室內(nèi)無菌狀態(tài)；安裝空氣過濾和恒溫恒濕裝置，恒溫溫度26 ℃左右；保持正壓，盡量減少與外界的空氣對流，減少塵埃與微生物侵入；通常由內(nèi)外間組成，外間為緩沖間，用于準(zhǔn)備工作。

（2）孵育區(qū)。主要為組織細(xì)胞提供適宜的溫度、氣氛，需保持清潔無塵，應(yīng)設(shè)置在實驗人員活動干擾少的區(qū)域。

（3）制備區(qū)。主要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)液和有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。應(yīng)設(shè)有試劑柜、實驗臺、上水道和電源等。

（4）儲存區(qū)。主要存放冰箱、烘箱、液氮罐以及各類實驗耗材等，也需保持清潔無塵。

（5）洗涮消毒區(qū)。主要進(jìn)行培養(yǎng)器皿的清洗、滅菌以及細(xì)胞培養(yǎng)廢液的后續(xù)處理等工作。應(yīng)配有柜子、加熱器、高壓蒸汽滅菌鍋、洗刷器皿、干燥箱、超聲波清洗器和水槽等。地面設(shè)置地漏并須排水通暢，裝修要求耐濕。

2 儀器配備與管理

細(xì)胞培養(yǎng)室空間有限，儀器配置應(yīng)以簡單實用為基本原則，根據(jù)各個功能區(qū)的劃分，細(xì)胞培養(yǎng)室所配置儀器及管理要求如下。

2.1 無菌操作區(qū)

（1）生物安全柜。使用制度：使用遵循預(yù)約原則；嚴(yán)格執(zhí)行生物安全柜的操作規(guī)程，擺放廢液杯和廢品杯各一只；潔凈臺內(nèi)也應(yīng)劃分不同的區(qū)域，如材料區(qū)、操作區(qū)、污物區(qū)等。

生物安全柜的選用原則：執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)是歐洲標(biāo)準(zhǔn)EN12469 和美國國家衛(wèi)生基金會的第 49 號標(biāo)準(zhǔn)（NSF49），根據(jù)防護(hù)程度的不同，生物安全柜可分為I 級、II 級和III 級三大類，可適用于不同生物安全等級媒質(zhì)的操作，生物安全柜選用原則見表1。

表1 生物安全柜選用原則

（2）培養(yǎng)箱。每天觀察二氧化碳壓力表，準(zhǔn)備備用鋼瓶以便及時換氣；定期更換水盤中的水，保證水質(zhì)清潔無菌；按細(xì)胞或人員劃分不同區(qū)域，按預(yù)定位置擺放培養(yǎng)器皿，方便查找；每隔一個月進(jìn)行一次培養(yǎng)箱高溫消毒。

（3）倒置顯微鏡。使用時應(yīng)嚴(yán)格遵循設(shè)備操作方法，短時不用可將光源調(diào)至最弱，避免頻繁開關(guān)；長時不用，應(yīng)及時關(guān)閉光源，以延長燈泡使用壽命；熒光模塊提前5 min 開啟預(yù)熱，開關(guān)間隔需大于30 min。

（4）細(xì)胞計數(shù)設(shè)備。一般選用血球計數(shù)板，即可滿足實驗計數(shù)所需，而經(jīng)費(fèi)充裕的實驗室可選購細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。

2.2 制備區(qū)

（1）純水儀。定期清洗過濾系統(tǒng)、更換濾柱、定期檢測水質(zhì)。

（2）恒溫水浴鍋。每次用完后，需排干水，洗凈并擦干水浴鍋內(nèi)部。

（3）離心機(jī)。轉(zhuǎn)速為500～5000 rpm，容量0.5～50 ml，離心前應(yīng)配平樣品。

2.3 儲藏區(qū)

（1）冰箱及超低溫冰箱。按其種類劃分不同區(qū)域，做好標(biāo)記并建立臺賬，定期除霜。

（2）液氮罐。定期檢查液氮容量，及時添加液氮；為減少液氮的流失，設(shè)定每周固定日期開啟液氮罐，存、取細(xì)胞株，并做好位置、時間、種類、數(shù)量、存放人等相關(guān)信息登記。

2.4 洗刷消毒區(qū)

（1）高壓滅菌鍋。屬于特種設(shè)備，專人專管，操作人員須考取R1 證。滅菌前確認(rèn)水位處于水位線標(biāo)記處，排凈滅菌器內(nèi)空氣，待滅菌液體為總?cè)萘康?/2～3/4，滅菌結(jié)束后，排凈滅菌器中的水，保持滅菌器無水垢。

（2）鼓風(fēng)干燥箱。注意溫度的設(shè)定，塑料器皿應(yīng)小于60℃。

3 日常管理制度

日常管理制度須涵蓋安全、衛(wèi)生、公共事務(wù)等幾方面的內(nèi)容。

3.1 安全管理制度

細(xì)胞培養(yǎng)室為相對密閉的空間，安全隱患不容小覷，因此提高學(xué)生的安全意識，進(jìn)行意外事故應(yīng)急培訓(xùn)并制定相關(guān)制度要求至關(guān)重要[14]。培養(yǎng)箱配備的二氧化碳鋼瓶務(wù)必做好固定措施，并定期進(jìn)行防漏檢查。實驗室應(yīng)配備防火安全設(shè)施，實驗人員應(yīng)熟練掌握防火安全設(shè)施的使用。實驗過程中產(chǎn)生的廢棄物，按指定要求進(jìn)行消毒處理后并送往相關(guān)回收部門，不應(yīng)隨意遺留在實驗平臺內(nèi)[15]。

3.2 衛(wèi)生管理制度

進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室之前首先應(yīng)保證個人衛(wèi)生，在緩沖間換上專用實驗服及專用拖鞋，戴上帽子和口罩。本細(xì)胞培養(yǎng)室專門建立了細(xì)胞實驗預(yù)約平臺，按預(yù)約原則進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室，并且同一時段最多可供4 人預(yù)約使用。每周安排1～2 名值日人員，對細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行全面的衛(wèi)生消毒，包括地面、培養(yǎng)箱、顯微鏡、桌面等各個角落，清潔完后進(jìn)行抽濕干燥、紫外消毒處理。另外還需清洗細(xì)胞培養(yǎng)室專用的實驗服和拖鞋。由專職人員每月對二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行一次高溫消毒。

3.3 公共事務(wù)管理制度

每周值日人員除衛(wèi)生工作以外還需要完成以下工作：配制消毒用的75%酒精，給細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)添加足夠的95%乙醇供酒精燈使用；處理細(xì)胞培養(yǎng)廢液、廢物；定期查看培養(yǎng)箱內(nèi)的水量；查看滅菌耗材的儲備情況，及時補(bǔ)充；檢查公用試劑的儲備情況。

4 人才培養(yǎng)及操作規(guī)范化管理

4.1 研究生實驗技能參差不齊

由于生物醫(yī)學(xué)工程是一門高度綜合的交叉學(xué)科，所招的研究生來源廣，專業(yè)分布寬，導(dǎo)致研究生的基本實驗技能差異大，給細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培訓(xùn)帶來一定的難度，如何面向這些不同生源、實驗技能差異較大的研究生開展好細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培訓(xùn)是目前亟待解決的問題。本細(xì)胞培養(yǎng)實驗平臺準(zhǔn)入培訓(xùn)流程如圖2 所示。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)室準(zhǔn)入培訓(xùn)流程

4.2 結(jié)合多媒體技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)理論培訓(xùn)

定期舉辦細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培訓(xùn)，結(jié)合多媒體技術(shù)，生動展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)信息、技術(shù)及安全規(guī)范，加強(qiáng)學(xué)生對基礎(chǔ)理論的理解，提高學(xué)生的生物安全意識。

（1）樹立無菌觀念，提高生物安全意識。離體細(xì)胞對病原微生物及病毒無抵抗力，無菌操作是整個細(xì)胞體外培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，細(xì)胞一旦感染，將因被奪營養(yǎng)物質(zhì)而生長緩慢或停滯，甚至死亡，因此，從接觸細(xì)胞培養(yǎng)實驗開始，就要讓學(xué)生形成嚴(yán)格的無菌觀念。細(xì)胞培養(yǎng)廢液、廢棄耗材的處理需嚴(yán)格遵循《醫(yī)療廢物管理條例》，防止病原微生物傳播，保護(hù)環(huán)境，保障人體健康[15]。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)理論培訓(xùn)。剛接觸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的學(xué)生，對細(xì)胞培養(yǎng)概念還比較模糊，培訓(xùn)過程中首先利用細(xì)胞培養(yǎng)實驗教學(xué)視頻，向?qū)W生逐個講解操作要點和注意事項，目的是讓學(xué)生充分了解細(xì)胞培養(yǎng)所需的常規(guī)儀器設(shè)備、原理及功能；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑的配制（完全培養(yǎng)基、PBS、凍存液等）；原代細(xì)胞培養(yǎng)、傳代細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞凍存及復(fù)蘇等實驗的原理及注意事項；以及細(xì)胞染色、細(xì)胞計數(shù)等基本實驗方法。

（3）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用。收集科研團(tuán)隊的細(xì)胞實驗結(jié)果，整理歸類，使用多媒體技術(shù)，向?qū)W生逐一介紹各類細(xì)胞實驗在生物醫(yī)學(xué)科研實驗中的相關(guān)應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用見圖3。

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

4.3 實際操作培訓(xùn)

（1）掌握細(xì)胞培養(yǎng)室各區(qū)域要求。由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及空間的特殊性，應(yīng)不急于讓學(xué)生進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室動手實驗，而是循序漸進(jìn)，先了解細(xì)胞培養(yǎng)室的各個布局及相關(guān)儀器的使用方法，對細(xì)胞培養(yǎng)室有個整體而充分的認(rèn)識，并向?qū)W生強(qiáng)調(diào)在進(jìn)行相應(yīng)的操作時，要嚴(yán)格遵守各區(qū)域的操作要求和規(guī)章制度。

（2）采用啟發(fā)式培訓(xùn)模式。培訓(xùn)內(nèi)容主要包括細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)（原代培養(yǎng)、細(xì)胞傳代、細(xì)胞鋪板、細(xì)胞凍存、細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞計數(shù)）和觀察檢測方法（CCK-8 檢測、DAPI 染色、Calcein-AM 熒光染色）兩個部分。由于參加培訓(xùn)的學(xué)生人數(shù)較多，難以在短時間內(nèi)安排所有學(xué)生進(jìn)入培養(yǎng)室進(jìn)行實驗操作，培訓(xùn)采取分批、分組進(jìn)入進(jìn)行實驗操作。在操作演示過程中，以問題為中心，培養(yǎng)學(xué)生的觀察與思考能力。采用“一問一答”的方式啟發(fā)學(xué)生多角度思考，設(shè)計如細(xì)胞培養(yǎng)氣氛為5%的CO2的作用，胰酶消化的原理，凍存液中加入DMSO 的作用等提問環(huán)節(jié)。通過這種啟發(fā)式的培訓(xùn)模式，能夠讓學(xué)生更好地理解和掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的理論知識，引導(dǎo)學(xué)生積極分析所觀察到的實驗現(xiàn)象，激發(fā)獨(dú)立解決問題的愿望，提高學(xué)生的實踐能力。

4.4 準(zhǔn)入考核

所有培訓(xùn)內(nèi)容結(jié)束之后，對學(xué)生進(jìn)行逐一考核，依照考核項目制定考核內(nèi)容與打分表。細(xì)胞培養(yǎng)室準(zhǔn)入考核內(nèi)容見表2，考核分?jǐn)?shù)需達(dá)90 分以上，方可進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室工作。為盡可能減少人為因素造成的細(xì)胞培養(yǎng)室污染，對新進(jìn)人員設(shè)定3 個月實習(xí)期，實習(xí)期內(nèi)無安全事故、無污染事故、認(rèn)真履行職責(zé)、服從安排者可獲長期使用權(quán)限。

表2 細(xì)胞培養(yǎng)室準(zhǔn)入考核內(nèi)容

5 結(jié)語

細(xì)胞培養(yǎng)公共實驗平臺是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞相關(guān)研究活動的重要場所，是生命科學(xué)領(lǐng)域科研產(chǎn)出的重要平臺，已成為生命科學(xué)類院校科研、教學(xué)的核心部分。搭建細(xì)胞培養(yǎng)實驗平臺，更為高效、合理地配置相關(guān)科研資源，便于科研人員進(jìn)行學(xué)術(shù)交流研究，需要全體師生的配合。由于細(xì)胞培養(yǎng)要求無菌操作，相比其他實驗室，對實驗人員的實驗技術(shù)及操作規(guī)范應(yīng)有更高的要求，只有建立健全規(guī)章制度，明確使用權(quán)限，完善管理體系，才能保證科研實驗順利進(jìn)行，使平臺運(yùn)行做到高效、完善和科學(xué)化。