胡思遠 陳 燕 朱佳龍 侯 量 尹來波

(石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，石河子 832000)

隨著環(huán)境變化，肺癌的發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重影響公眾健康[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的一種類型，占全部肺癌的80%左右[2]。以CT為代表的影像學(xué)方法是臨床上篩查NSCLC的主要手段，但由于肺組織本身的質(zhì)地、影像學(xué)診斷方法的靈敏度，并不能完全滿足臨床需要[3]。因此尋找NSCLC的新型篩查與早期診斷方法，加強檢測手段靈敏度，同時減少檢測造成的創(chuàng)傷與花費，是提高NSCLC臨床診療方案的發(fā)展方向。隨著表觀遺傳學(xué)不斷發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)肺組織的癌變的一大因素是多種基因的異常改變，包括編碼區(qū)及非編碼區(qū)靶基因的抑制或過表達[4]。長鏈非編碼(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200 nt的不編碼蛋白質(zhì)的RNA，研究表明，lncRNA通過調(diào)控基因的表達廣泛參與機體的多種生理、病理過程，尤其在多種惡性腫瘤中異常表達，有成為腫瘤標(biāo)記物的潛力[5]。本研究選擇lncRNA DB327252為研究對象，以實時熒光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測lncRNA DB327252表達，以探討其在NSCLC的發(fā)生與惡性進展過程中的作用，并預(yù)測其成為NSCLC診斷、預(yù)后相關(guān)腫瘤標(biāo)志的可能性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意，選取2015年6月～2017年3月我院收治的NSCLC患者91例，后依據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)排除11例，因失訪排除1例，共入組79例。本院NSCLC確診標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2015年第1版《NCCN非小細(xì)胞肺癌臨床實踐指南》[6]。樣本由根治性或姑息性切除術(shù)于術(shù)中切取，NSCLC組織取自腫瘤組織中心，癌旁組織為腫瘤邊緣的正常組織。另取20例同期肺外傷患者的正常肺組織作為對照。本研究選擇的NSCLC患者中，年齡≤55歲35例，55歲以上44例，平均年齡(59±7.22)歲；男性45例，女性34例；病歷資料顯示無吸煙史31例，有吸煙史48例；經(jīng)病理科診斷，組織學(xué)類型為腺癌49例，鱗癌29例，鱗腺癌1例；腫瘤直徑≤3 cm者45例，>3 cm者34例；依據(jù)2009年修訂后的第7版NSCLC國際分期[7]分為：TNM分期Ⅰ期3例，Ⅱ期31例，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。

本研究納入標(biāo)準(zhǔn)為：①臨床病歷資料、隨訪資料完整，凍存標(biāo)本保存完好；②經(jīng)病理科確診為原發(fā)性NSCLC；③術(shù)前未經(jīng)放、化療等其他抗腫瘤手段治療。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①患者未遵醫(yī)囑按療程治療；②患有影響qRT-PCR結(jié)果的疾病；③患有顯著影響生存時間的其他嚴(yán)重疾?。虎芑颊咭馔馍砉?。

1.1.2試劑與儀器 TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；PrimeScript RT試劑盒(日本TaKaRa公司)；DEPC處理水(信帆生物)；BeyoFASTTMSYBR qPCR Mix(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司)；無水乙醇和氯仿均購自國藥集團。UV-8000型紫外分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)；T100型PCR儀(美國Bio-Rad公司)；S700型切片機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；PRO200型電動勻漿機(德國FLUKO公司)；移液槍(吉爾森P型移液器公司)。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測lncRNA DB327252表達 每份凍存標(biāo)本稱取100 mg樣本，TRIzol法提取總RNA，以紫外分光光度計檢測總RNA純度，取OD260/OD280在1.8～2.0之間的總RNA樣本。利用PrimeScript RT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為30 μl，檢測過程嚴(yán)格遵循BeyoFastTMSYBR qPCR Mix說明書。以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)引物序列為：①lncRNA DB327252：F：5′-AGCTCTCCTTCCCCTCTCAG-3′，R：5′-ATCTGAATGCCAGCAAGGCT-3′；②GAPDH：F：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，R：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。 以2-ΔΔCt法計算lncRNA DB327252的相對表達量。

1.2.2隨訪 以患者出院為觀察起點，利用電話、電子通訊，結(jié)合患者復(fù)診病歷，對患者及家屬進行隨訪。隨訪截止于2017年12月，隨訪時長9～21個月，平均(12.79±5.67)個月，中位隨訪時長為11個月。

2 結(jié)果

2.1lncRNA DB327252在不同肺組織中表達 由表1可知，lncRNA DB327252在NSCLC組織中表達水平(2.472±0.381)明顯高于癌旁組織(1.267±0.179)與正常肺組織(1.005±0.213)(P<0.05)。

2.2NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA DB327252表達水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系 NSCLC組織中l(wèi)ncRNA DB327252的表達水平與吸煙史、組織學(xué)類型、腫瘤大小、TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 NSCLC組織中l(wèi)ncRNA DB327252的表達與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系Tab.1 Relationship between expression of lncRNA DB327252 in NSCLC tissues and clinicopatholo-gical parameters of

2.3NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA DB327252表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系 以NSCLC組織中l(wèi)ncRNA DB327252表達水平的算術(shù)平均數(shù)0.472將患者分為低表達組38例與高表達組41例，將隨訪結(jié)果繪制成Kaplan-Meier生存曲線(圖1)。由此可知，lncRNA DB327252低表達組患者生存率為67.6%，中位生存時間為(46.92±3.30)個月，95%CI為(35.74，47.18)個月，lncRNA DB327252高表達組生存率為34.1%，中位生存時間為(41.46±12.92)個月，95%CI為(340.466，53.37)個月。Log Rank統(tǒng)計結(jié)果顯示，lncRNA DB327252低表達組患者預(yù)后顯著優(yōu)于lncRNA DB327252高表達組患者(χ2=7.900，P=0.005)。

圖1 Kaplan-Meier分析NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA DB327252的表達對患者預(yù)后的影響Fig.1 Kaplan-Meier analysis of effect of expression of lncRNA DB327252 in NSCLC tissues on prognosis of patients

3 討論

據(jù)公共衛(wèi)生部門統(tǒng)計，在我國，以NSCLC為代表的肺癌的發(fā)病率及死亡率具有一定的性別差異，其中男性發(fā)病率及死亡率均為所有惡性腫瘤最高，女性發(fā)病率為第四，死亡率位居第二，均屬于惡性腫瘤的前列，是我國國民健康的一大威脅[8]。NSCLC初期癥狀較輕，以胸部隱痛、悶痛等非特異性癥狀為主，影像學(xué)特征不明顯，多數(shù)患者確診時已為晚期，5年生存率僅20%左右[9]。外科手術(shù)結(jié)合術(shù)后化療、放療等綜合抗腫瘤治療方案是目前臨床上治療NSCLC的主要手段[10]。目前臨床確診NSCLC的金標(biāo)準(zhǔn)依然是常規(guī)病理切片光鏡檢查，但由于腫瘤組織的異質(zhì)性、切片部位大小及診斷醫(yī)師的能力等多種因素，一般無法做到準(zhǔn)確的分型，進而影響治療方案的個體化，臨床上治療方案總體有效率僅在30%上下波動，患者的中位生存時間僅為1年左右[11]。因而臨床亟需尋找能夠應(yīng)用于早期診斷、明確診斷及評估患者預(yù)后的生物標(biāo)記物。

關(guān)于腫瘤生物學(xué)機制的研究，一開始的焦點在于各種編碼蛋白質(zhì)基因的表達調(diào)控與突變，隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)非編碼基因同樣具有重要的生物學(xué)功能[12]。依據(jù)轉(zhuǎn)錄本長度而得名的lncRNA是非編碼RNA中研究較少的一類，近來的研究表明lncRNA與機體的各項生理與病理活動密切相關(guān)，基因?qū)蛹壣媳憩F(xiàn)為參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控等，臨床上則與心血管系統(tǒng)、退行性疾病、結(jié)核等感染性疾病及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)[13-21]。由于研究時間較短，目前功能明確的lncRNA僅有少數(shù)，但已發(fā)現(xiàn)數(shù)種lncRNA與NSCLC相關(guān)。Zhang等[22]對比NSCLC與非腫瘤癌旁組織中多種lncRNA的表達情況發(fā)現(xiàn)，促癌基因lncRNA HOTAIR、H19與MALAT1在NSCLC組織中呈高表達，而lncRNA PANDAR與TUG1的表達則被顯著抑制，同時后續(xù)隨訪結(jié)果則表明納入該研究的lncRNA均顯示出顯著的預(yù)后評估功能。Sun等[23]則發(fā)現(xiàn)，lncRNA XIST的表達與NSCLC對順鉑的耐藥性相關(guān)，而敲除了lncRNA XIST的腫瘤組織耐藥性有所回落，因此lncRNA XIST可能作為促進化療藥物療效的靶點得到臨床應(yīng)用。本研究則探討了一種新的lncRNA在NSCLC臨床診療活動中可能的應(yīng)用前景。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA DB327252在NSCLC組織的表達顯著高于非腫瘤癌旁組織與正常肺組織中，因此lncRNA DB327252有成為肺癌早期篩查標(biāo)志的潛力。而具有吸煙史、腫瘤較大、TNM分期較晚的NSCLC患者組織中l(wèi)ncRNA DB327252的表達顯著高于對照組，且與性別、年齡無關(guān)，提示lncRNA DB327252的表達與NSCLC的惡性程度相關(guān)，其可能參與NSCLC的惡性進展。同時，lncRNA DB327252的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示lncRNA DB327252對NSCLC的促進應(yīng)當(dāng)在于腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等方面，而與轉(zhuǎn)移、侵襲無關(guān)。但具體的機制尚需進一步的實驗證實。

本研究隨訪結(jié)果顯示，lncRNA DB327252表達較高的患者組生存時間、生存率等預(yù)后指標(biāo)均顯著差于lncRNA DB327252表達較低的患者組，因此lncRNA DB327252具有一定的預(yù)后評估潛力。對lncRNA DB327252表達較高的NSCLC患者，應(yīng)適當(dāng)采用聯(lián)合抗腫瘤治療方案，注意復(fù)診，加強監(jiān)護，以改善患者預(yù)后。

綜上所述，lncRNA DB327252在NSCLC組織中異常高表達，lncRNA DB327252表達較高的NSCLC惡性程度較高，且與患者預(yù)后相關(guān)。因此lncRNA DB327252有成為NSCLC早期篩查、預(yù)后評估相關(guān)腫瘤標(biāo)記物的潛力。