陳 敏 郭愛元 付楚涵 竇建華 丁玉芳 黃進(jìn)華

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬三醫(yī)院皮膚科，長沙 410013)

黑色素瘤是一種由黑素細(xì)胞過度增生引起的皮膚腫瘤，多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的黏膜，是目前發(fā)病率增高最快的惡性腫瘤之一[1]。黑色素瘤形成及發(fā)展的過程存在免疫逃逸機(jī)制，腫瘤細(xì)胞通過分泌大量免疫抑制因子逃避機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[2,3]。黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移往往導(dǎo)致患者預(yù)后較差。目前的治療方式仍不能達(dá)到令人滿意的效果，近期發(fā)現(xiàn)免疫治療在多種實(shí)體瘤中取得較顯著的療效，因此免疫機(jī)制的研究對(duì)于黑色素瘤的免疫治療具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性小分子RNA，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡等生理病理過程[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miR-21與黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展、分期和預(yù)后密切相關(guān)[5-7]。研究顯示miR-21可能是黑色素瘤潛在的治療靶標(biāo)，抑制其表達(dá)能夠誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。金屬蛋白酶組織抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3)是各種癌細(xì)胞中的促凋亡蛋白，被鑒定為miR-21的靶基因[9]。目前有報(bào)道顯示在乳腺癌荷瘤小鼠模型研究中，抑制腫瘤細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，能夠促進(jìn)IL-10、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等細(xì)胞因子的釋放，調(diào)控免疫效應(yīng)，抑制荷瘤鼠腫瘤的生長[10]。在黑色素瘤細(xì)胞中miR-21是否靶向調(diào)控TIMP3參與免疫反應(yīng)的研究鮮有報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上驗(yàn)證miR-21和TIMP3的靶向調(diào)控作用，并對(duì)免疫抑制因子的影響進(jìn)行初步分析，以期為黑色素瘤的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 22例皮膚惡性黑色素瘤組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本收集于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬三醫(yī)院2016年1月至2018年1月間病理科。22例黑色素瘤患者在切除手術(shù)后均經(jīng)病理診斷確診，患者術(shù)前均未行放療、化療及其他形式的抗腫瘤治療。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬三醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。所有標(biāo)本收集后儲(chǔ)存于液氮中。

1.1.2材料與試劑 黑色素瘤細(xì)胞株SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2(美國ATCC)；人正常表皮黑色素細(xì)胞株HeMa-Lp(上海斯信生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、M-254培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素、鏈霉素(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Thermo Scientific公司)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；SYBR Green Master Mix檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；miR-21mimic、mimic control、miR-21 inhibitor、inhibitor control(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)；引物及測序(上海生工生物工程股份有限公司)；BCA蛋白定量檢測試劑盒、ECL檢測試劑盒(上海浩然生物技術(shù)有限公司)；TIMP3抗體及二抗(美國Cell Signaling Technology公司)；IL-10 ELISA檢測試劑盒、TGF-β ELISA檢測試劑盒、VEGF ELISA檢測試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 黑色素瘤細(xì)胞株SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2培養(yǎng)在含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，人正常表皮黑色素細(xì)胞株HeMa-Lp培養(yǎng)在含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的M-254培養(yǎng)基中，均置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁生長融合度達(dá)90%時(shí)以胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2qRT-PCR檢測組織和細(xì)胞中miR-21的表達(dá) 采用Trizol試劑分別提取皮膚惡性黑色素瘤組織、配對(duì)癌旁組織標(biāo)本中以及各細(xì)胞株中總RNA。經(jīng)分光光度計(jì)檢測RNA純度和濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以SYBR Green Master Mix熒光定量檢測試劑盒擴(kuò)增miR-21和內(nèi)參。引物序列：U6引物：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，R：5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′。 miR-21引物：F：5′-CCGGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATT-TTTTG-3′，R：5′-AATTCAAAAAATAGCTTATCAG-3′。 20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)每組Ct值，2-ΔΔCt法計(jì)算組織和細(xì)胞中miR-21相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)的A375細(xì)胞系制備細(xì)胞懸液，并轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行鋪板，3.0×105個(gè)/孔。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，生長狀態(tài)良好的細(xì)胞參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以轉(zhuǎn)染miR-21 mimic的細(xì)胞為miR-21組，以轉(zhuǎn)染mimic control的細(xì)胞為miR-NC組，以轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor的細(xì)胞為anti-miR-21組，以轉(zhuǎn)染mimic control的細(xì)胞為anti-miR-NC組，以不做任何處理的細(xì)胞為Control組。轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h以qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平，方法同1.2.2。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于檢測IL-10、TGF-β和VEGF的含量。

1.2.4ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別按照IL-10、TGF-β、VEGF ELISA檢測試劑盒說明書操作，采用雙抗夾心ELISA法檢測上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 通過TagetScan生物信息學(xué)軟件進(jìn)行靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-21與TIMP3存在結(jié)合位點(diǎn)。將TIMP3 3′ UTR與miR-21結(jié)合序列擴(kuò)增并連接到熒光素酶報(bào)告基因載體pmirGLO上；同時(shí)將TIMP3 3′ UTR與miR-21結(jié)合序列位點(diǎn)突變的序列連接到熒光素酶報(bào)告基因載體pmirGLO上。將構(gòu)建好的載體送測并將鑒定正確的質(zhì)粒與miR-21 mimic共轉(zhuǎn)染至黑色素瘤A375細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)染mimic control為對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞，以雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒測定Firefly熒光素酶活性和Renilla熒光素酶活性，統(tǒng)計(jì)每組相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.6Western blot檢測細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)水平 分別收集轉(zhuǎn)染后24 h各組A375細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，加入蛋白裂解液置冰上裂解，提取各組細(xì)胞中總蛋白。經(jīng)BCA蛋白定量檢測試劑盒測定所提取蛋白濃度后，將蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混合加熱至蛋白變性，取50 μg變性蛋白以SDS-GAGE進(jìn)行電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后放置于含10%脫脂奶粉的封閉液中孵育4 h，取出后加入一抗(1∶1 000)4℃過夜進(jìn)行雜交，取出后洗滌，加入二抗(1∶3 000)，洗滌后以ECL化學(xué)發(fā)光，在成像系統(tǒng)中拍照，以β-actin為內(nèi)參，采用Image Pro圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)各條帶灰度值，計(jì)算各組細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0分析，以單因素方差分析比較多組差異，以SNK-q檢驗(yàn)比較組間差異，每組數(shù)據(jù)代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-21在黑色素瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá) 采用qRT-PCR檢測黑色素瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-21的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1A所示，與癌旁組織比，黑色素瘤組織中miR-21的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。檢測不同黑色素瘤細(xì)胞株及正常表皮黑色素細(xì)胞株中miR-21的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1B所示，與正常表皮黑色素細(xì)胞相比，黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2中miR-21的表達(dá)水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鑒于miR-21在不同黑色素瘤細(xì)胞株的表達(dá)水平，選擇黑色素瘤細(xì)胞A375用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同組織和細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of miRNA-21 in different tissues and cells

2.2轉(zhuǎn)染miR-21 mimic對(duì)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β和VEGF含量的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與miR-NC相比，miR-21組細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。ELISA檢測結(jié)果顯示，與miR-NC相比，miR-21組上清中IL-10、TGF-β和VEGF含量均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B～D)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-21 mimic對(duì)細(xì)胞中miR-21表達(dá)及上清中IL-10、TGF-β和VEGF含量的影響Fig.2 Effects of miR-21 mimic transfection on expression of miR-21 in cells and contents of IL-10,TGF-β and VEGF in supernatant

2.3轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor對(duì)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β和VEGF含量的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC相比，anti-miR-21組細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A)。ELISA檢測結(jié)果顯示，與miR-NC相比，miR-21組上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3B～D)。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor對(duì)細(xì)胞中miR-21的表達(dá)及上清中IL-10、TGF-β和VEGF的含量的影響Fig.3 Effects of miR-21 inhibitor transfections on expression of miR-21 in cells and contents of IL-10,TGF-β and VEGF in supernatants

2.4TIMP3是miR-21的靶基因 生物信息學(xué)軟件TagetScan預(yù)測miR-21與TIMP3靶向結(jié)合位點(diǎn)，如圖4A所示，miR-21能夠與TIMP3 3′UTR靶向結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-21和TIMP3靶向結(jié)合關(guān)系，如圖4B所示，與mimic control和TIMP3 3′UTR野生型共轉(zhuǎn)染組相比，miR-21 mimic組和TIMP3 3′UTR野生型共轉(zhuǎn)染組相對(duì)熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與mimic contro組和TIMP3 3′UTR突變型共轉(zhuǎn)染組相比，miR-21 mimic組和TIMP3 3′UTR突變型共轉(zhuǎn)染組相對(duì)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上實(shí)驗(yàn)說明TIMP3是miR-21的靶基因。

圖4 TIMP3和miR-21靶向結(jié)合關(guān)系驗(yàn)證Fig.4 Validation of target-binding relationship between TIMP3 and miR-21

2.5miR-21靶向調(diào)控TIMP3的表達(dá) Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC相比，miR-21細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5A)。與anti-miR-NC相比，anti-miR-21組細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5B)。

圖5 轉(zhuǎn)染miR-21 mimic及inhibitor后細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression of TIMP3 protein in cells transfected with miR-21 mimic and inhibitor

3 討論

黑色素瘤是皮膚常見惡性腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且預(yù)后效果較差，死亡率較高。近年來免疫治療在癌癥治療中取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，讓越來越多的學(xué)者看到了免疫治療的前景。免疫治療在黑色素瘤的綜合治療中發(fā)揮重要作用，但腫瘤免疫逃逸大大影響了免疫治療的效果[11]。因此對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究在腫瘤免疫治療中顯得尤為重要。參與腫瘤免疫逃逸的免疫抑制分子包括IL-10、TGF-β1等，這些免疫抑制分子參與腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視及細(xì)胞轉(zhuǎn)型，為腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和增殖提供有利條件[12-14]。IL-10具有抑制巨噬細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞增殖的功能，在腫瘤免疫中發(fā)揮主要作用[15]。TGF-β1能夠抑制T細(xì)胞的增殖、分化及活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[16]。VEGF參與腫瘤血管發(fā)生及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程，影響細(xì)胞毒性T細(xì)胞生物殺傷效應(yīng)[17]。IL-10、TGF-β1和VEGF等細(xì)胞因子水平的增高能夠抑制免疫反應(yīng)，逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移[18]。因此通過對(duì)腫瘤的免疫逃逸機(jī)制的研究能夠更清楚地了解腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程，可從提高機(jī)體免疫能力，逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫逃逸等多角度為黑色素瘤的免疫治療提供新思路。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測黑色素瘤患者組織和不同黑色素瘤細(xì)胞株中miR-21的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-21在黑素色瘤組織和細(xì)胞中均呈低表達(dá)。通過在黑色素瘤A375細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21 mimic，上調(diào)A375細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，經(jīng)ELISA檢測發(fā)現(xiàn)IL-10、TGF-β1和VEGF的含量顯著升高；下調(diào)A375細(xì)胞中miR-21的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的分泌。表明miR-21能夠下調(diào)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的表達(dá)。與Chen等[19]關(guān)于丙型肝炎病毒感染上調(diào)miR-21的表達(dá)，靶向TLR信號(hào)通路的效應(yīng)因子，參與逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視的研究相符。He等[20]的研究同樣顯示miR-21能夠介導(dǎo)免疫應(yīng)答，且能夠影響小鼠移植瘤的生長。miR-21在免疫應(yīng)答和炎癥性疾病中起重要作用，且可通過抑制NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，在自身免疫性淋巴組織增生綜合征中發(fā)揮重要作用[21-23]。此外本實(shí)驗(yàn)通過生物學(xué)軟件預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-21和TIMP3靶向結(jié)合關(guān)系，通過Western blot檢測上調(diào)或下調(diào)miR-21的表達(dá)對(duì)A375細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)的影響，顯示miR-21能夠負(fù)向調(diào)控TIMP3的表達(dá)。與Nagao[24]和Gutsaeva等[25]miR-21能夠靶向調(diào)控TIMP3的研究一致。綜合以上實(shí)驗(yàn)，miR-21通過靶向抑制TIMP3表達(dá)影響細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的分泌參與黑色素瘤免疫逃逸。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-21靶向負(fù)調(diào)控TIMP3的表達(dá)調(diào)控黑色素瘤免疫逃逸，其作用機(jī)制可能與調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的含量有關(guān)。下調(diào)細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，提高相關(guān)免疫抑制分子的分泌，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤的免疫逃逸，為黑色素瘤的免疫治療提供候選作用靶點(diǎn)。