李 敏 王健寶 楊大艷

(海南省瓊海市人民醫(yī)院超聲科，瓊海 571400)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤[1]。其中，三陰性乳腺癌占所有乳腺癌的15%，與其他乳腺癌亞型相比，其長期預(yù)后較差,是全球女性死亡的重要原因[2]。手術(shù)切除是目前最有效的治療手段，盡管如此，三陰性乳腺癌的復(fù)發(fā)率仍然很高[3]。另外，由于缺乏分子靶標(biāo)，目前化學(xué)療法是唯一可用于三陰性乳腺癌的全身性治療方法。早期三陰性乳腺癌患者接受化療后，約30%～40%的患者已發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病并因此死亡[4]。因此，迫切需要尋找有效的三陰性乳腺癌分子靶標(biāo)及開發(fā)新的治療策略。

microRNA(miRNA)是長度約18～22 bp的內(nèi)源非編碼RNA，可以與目標(biāo)mRNA 3′-UTR區(qū)的目標(biāo)位點(diǎn)結(jié)合而參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，從而引起目標(biāo)mRNA降解或翻譯抑制[5]。據(jù)報道，miRNA通過根據(jù)細(xì)胞環(huán)境特異性調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)來充當(dāng)致癌基因或抑癌基因[6]。在乳腺癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多miRNA的異常表達(dá)[7]。并且一些miRNA在乳腺癌中的作用已經(jīng)被研究，例如miR-145-5p通過靶向SOX6抑制乳腺癌細(xì)胞活力[8]；miR-328-5p通過抑制RAGE的表達(dá)從而調(diào)控三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖[9]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中miR-126表達(dá)異常，在乳腺癌細(xì)胞侵襲和血管生成中發(fā)揮重要作用，因此miR-126可能是乳腺癌診斷、治療和預(yù)后的有效分子靶標(biāo)[10，11]。

CRK(CRK proto-oncogene，adaptor protein)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的信號接合物蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)受體整合蛋白和酪氨酸激酶等網(wǎng)絡(luò)信號分子的信號傳導(dǎo)。在許多癌癥中發(fā)現(xiàn)CRK有助于腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[12-14]。在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)CRK的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)[15]。且CRK被發(fā)現(xiàn)是miR-126的靶標(biāo)基因，在許多種癌癥，例如胃癌、胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌等中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-126通過調(diào)控CRK的表達(dá)影響腫瘤惡性生物學(xué)行為[16-18]。但miR-126是否通過調(diào)節(jié)CRK的表達(dá)影響乳腺癌的發(fā)展還不得而知。

目前已經(jīng)針對癌癥治療開發(fā)了一系列基因療法，其中超聲微泡介導(dǎo)的基因傳遞可提高基因的傳遞效率且不引起細(xì)胞損傷，可能是未來癌癥基因治療的有效手段。為此，本研究利用超聲技術(shù)提取脂質(zhì)微泡，與miR-126模擬物融合，在體外探究超聲介導(dǎo)的miR-126對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床樣本 選取我院2018年1月～2019年10月手術(shù)切除并經(jīng)病理鑒定的72例女性乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織。按照TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期42例。其中40歲以下34例，40歲及以上患者38例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療或化療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.1.2主要試劑 胰蛋白酶、胎牛血清、不完全培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素和LipofectamineTM2000 Reagent購于Invitrogen公司；TRIzol RNA提取試劑盒購于北京天健生物技術(shù)有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、PrimescripTMRT reagent Kit、miRNA PrimescripTMRT reagent Kit購于TaKaRa公司；引物委托Sangon Biotech(中國上海)合成；蛋白提取試劑盒購于南京凱基生物公司；Bcl-2、Bax、c-Caspase-3、pro-Caspase-3和GAPDH特異性抗體以及二抗IgG2購于美國Abcam公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天公司；Cell-light EdU熒光檢測試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司；Trasnwell小室購于Millipore公司。

1.1.3細(xì)胞來源 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231(三陰性)以及人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在含有100 U/ml青霉素、50 mg/ml鏈霉素的10 %胎牛血清的完全培養(yǎng)基(DMEM/FBS)中貼壁生長培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理 MDA-MB-231細(xì)胞按1×105個/孔接種于6孔板，在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用LipofectamineTM2000與NC mimic、miR-126 mimic、NC-OE和CRK-OE質(zhì)粒輕輕混勻后靜置，室溫孵育20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液上清，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用RT-PCR和Western blot檢測miRNA的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3微泡的制備 參照文獻(xiàn)[19]的實驗方案，制備微泡。將聚乙二醇40硬脂酸酯(1 mg/ml)、1-雙硬脂?；字Ｄ憠A(2 mg/ml)、1,2-雙硬脂酰基-3三氟甲基丙烷(0.4 mg/ml)和十氟丁烷混合置于超聲鍋中，超聲獲得陽離子脂質(zhì)MB。通過倒置熒光顯微鏡和納米粒度分析儀來觀察和檢測合成的MB。利用無菌濾膜過濾得到純凈無菌的MB。將1 μg miR-mimic與50 μl MB懸浮液混合，并在37℃下培養(yǎng)30 min。用0.16 mol/L PBS洗去未結(jié)合的miR-126，得到miR-126-MB。

1.2.4qPCR檢測mRNA表達(dá) 根據(jù)試劑盒說明書提取乳腺癌組織和細(xì)胞的總RNA，將RNA濃度統(tǒng)一稀釋為500 ng/μl。使用PrimeScript RT和miRNA PrimescripTMRT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒作為qPCR擴(kuò)增模板。在LightCycle 96熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR。U6和GAPDH分別用作miR-126和CRK的內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物列表Tab.1 Primer list of RT-qPCR

1.2.5Western blot 利用RIPA從組織或細(xì)胞中分離出蛋白質(zhì)。將相同濃度的蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混合后95℃煮沸10 min，然后將20 μl的混合物加入10%的聚丙烯酰胺凝膠平板中，電泳分離蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，在4℃下與一抗(1∶3 000)孵育過夜。樣品用TBST洗滌，與二抗(1∶10 000)在室溫黑暗環(huán)境下孵育1 h。GAPDH用作內(nèi)參，用ImageJ測定蛋白條帶灰度。

1.2.6細(xì)胞活力 刮取培養(yǎng)基上生長的MDA-MB-231細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)液中，懸浮培養(yǎng)。在96孔板中按5 000個/孔接種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，加入10 μl PBS溶解的MTT溶液，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4～6 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測吸光度值。

EdU染色法：使用Cell-light EdU熒光檢測試劑盒測定細(xì)胞活力。按照說明進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取視野進(jìn)行拍攝。藍(lán)色熒光代表所有細(xì)胞，而紅色熒光代表由EdU染色的細(xì)胞。

1.2.7細(xì)胞凋亡測定 各組MDA-MB-231細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h之后，低速離心5 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞1次，棄上清。在6孔板中按1×105個/孔接種細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后根據(jù)試劑盒的操作流程，利用流式細(xì)胞儀檢測不同處理下細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.8細(xì)胞侵襲測定 將1×105個轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細(xì)胞接種于Matrigel覆蓋的Transwell小室上層，底部充滿常規(guī)培養(yǎng)基。24 h后取出小室，乙酸和甲醛的混合液固定細(xì)胞15 min，PBS沖洗3次，用棉簽擦去未穿過小室的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后用PBS沖洗3次。隨機(jī)選擇視野進(jìn)行拍照，Image J軟件計算發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism8軟件繪圖并進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間數(shù)據(jù)差異采用t檢驗(Student′sttest)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-126在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào) miR-126在乳腺癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁組織(圖1A)。相比于MCF-10A細(xì)胞，兩種乳腺癌細(xì)胞中miR-126的表達(dá)都明顯降低，在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中miR-126的表達(dá)量低于MCF-7細(xì)胞系，在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)變化更為明顯(圖1B)。因此后續(xù)實驗采用MDA-MB-231細(xì)胞。

圖1 miR-126在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況Fig.1 Expression level of miR-126 on breast cancer tissues and cells

2.2miR-126表達(dá)與臨床乳腺癌發(fā)展有關(guān) 分析72例患者乳腺癌組織中miR-126的表達(dá)情況和患者年齡、腫瘤大小和腫瘤分期等指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果表明miR-126的表達(dá)與患者年齡、是否絕經(jīng)無顯著相關(guān)性，而與乳腺癌腫瘤大小、是否為三陰性和腫瘤分期顯著相關(guān)。見表2。

表2 miR-126表達(dá)與乳腺癌臨床特征的關(guān)系(n)Tab.2 Relationship of miR-126 expression and clinical features of breast cancer(n)

2.3微泡的鑒定 熒光顯微鏡檢查結(jié)果顯示微泡呈球形且均勻分散，無明顯聚集(圖2A)。大部分微泡直徑約5 μm(圖2B)。將微泡與正常乳腺細(xì)胞MCF-10A共培養(yǎng)，結(jié)果顯示微泡對MCF-10A細(xì)胞活力無影響(圖2C)。

圖2 微泡的鑒定Fig.2 Identification of microbubbles

2.4超聲微泡介導(dǎo)的miR-126顯著抑制乳腺癌細(xì)胞活力 用miR-126 mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞或用miR-126-MB處理細(xì)胞，qPCR檢查各組細(xì)胞中miR-126的表達(dá)情況(圖3A)。相比于對照組、空載組和微泡組，miR-126 mimic組和miR-126-MB組的細(xì)胞活力和侵襲能力顯著降低，并且miR-126-MB組細(xì)胞活力和侵襲能力比miR-126 mimic組更低(P<0.05，圖3B、C)。流式細(xì)胞術(shù)和Western blot結(jié)果表明，過表達(dá)miR-126和微泡介導(dǎo)的miR-126導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞凋亡比例增加，尤其超聲微泡介導(dǎo)的miR-126顯著增加乳腺癌細(xì)胞凋亡比例(P<0.05，圖3D、E)。

圖3 微泡介導(dǎo)的miR-126對乳腺癌細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of ultrasound-microbubbles-mediated miRNA-126 on activities of breast cancer cells

2.5miR-126調(diào)節(jié)CRK的表達(dá) 檢測miR-126對CRK mRNA和蛋白水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-126導(dǎo)致CRK水平降低，微泡介導(dǎo)的miR-126進(jìn)一步抑制CRK表達(dá)(P<0.05，圖4A、B)。

圖4 miR-126在乳腺癌細(xì)胞中靶向調(diào)節(jié)CRK表達(dá)Fig.4 miR-126 regulated CRK expression in breast cancer cell

2.6超聲微泡介導(dǎo)miR-126通過調(diào)節(jié)CRK抑制乳腺癌細(xì)胞活性 功能性實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)CRK顯著提高了MDA-MB-231細(xì)胞的活力和侵襲能力，并抑制了MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，但是同時過表達(dá)miR-126和CRK導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞活力部分降低，并且微泡介導(dǎo)的miR-126進(jìn)一步降低了CRK誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞活力(圖5)。

圖5 miR-126通過調(diào)節(jié)CRK的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞活力Fig.5 miR-126 inhibited activities of breast cancer cells by regulating CRK expression

3 討論

乳腺癌是女性致命癌癥，尤其是三陰性乳腺癌由于早期缺乏可靠的標(biāo)記物導(dǎo)致5年生存率較低[21]。目前已經(jīng)證實miR-126在乳腺癌中的作用，miR-126過表達(dá)抑制了MCF-7細(xì)胞增殖和乳腺癌中血管生成[11]。另外，超聲微泡是眾所周知的納米氣泡，具有高安全性、穩(wěn)定性和提高轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)點(diǎn)[22]。超聲微泡介導(dǎo)的miRNA基因療法的可行性已經(jīng)在肺癌、肝癌等癌癥中被證實[23,24]。因此，假設(shè)超聲微泡介導(dǎo)的miR-126在乳腺癌細(xì)胞活力中可能具有抑制作用。相應(yīng)的結(jié)果表明，miR-126的過表達(dá)顯著抑制了三陰性乳腺癌MDA-MB-231的細(xì)胞活力和侵襲能力，并且由超聲微泡介導(dǎo)的miR-126可以進(jìn)一步增強(qiáng)miR-126對MDA-MB-231生長的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-126在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與既往研究結(jié)果一致[10]。同時，調(diào)查miR-126的表達(dá)與乳腺癌患者的臨床特征發(fā)現(xiàn)，在腫瘤直徑大于2 cm患者、三陰性乳腺癌患者和TMN分期為3～4期的患者中miR-126表達(dá)明顯下調(diào)。該結(jié)果表明，miR-126有望作為三陰性乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后的關(guān)鍵分子靶標(biāo)，功能性實驗表明miR-126的過表達(dá)顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞活力和侵襲能力，并有效誘導(dǎo)其凋亡，與既往研究結(jié)果一致[25]。但王承正等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-126對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力有一定影響，而對增殖能力無明顯影響。鑒于miR-126在多種癌細(xì)胞中被證明對細(xì)胞增殖有抑制作用，而且本研究EdU染色結(jié)果也表明miR-126對MDA-MB-231細(xì)胞活力有一定影響。且由超聲微泡介導(dǎo)的miR-126具有更強(qiáng)的效果。說明超聲微泡介導(dǎo)的miR-126有望成為治療乳腺癌的一種有效方法。

此外，CRK是miR-126的特異性靶標(biāo)。先前一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CRK具有調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展的作用。例如在膀胱癌中，CRK通過HGF/c-Met反饋環(huán)誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[6]；另外，CRK的失調(diào)會促進(jìn)胃癌的發(fā)展[27]。重要的是，在乳腺癌中也證實了CRK作為促癌基因影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，CRK通過促進(jìn)PD-L1的表達(dá)促進(jìn)三陰性乳腺癌小鼠中EMT過程和免疫逃逸[28]；另外，CRK的磷酸化水平也和乳腺癌致瘤性和轉(zhuǎn)移有關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-126能特異性調(diào)控CRK的表達(dá)并抑制MDA-MB-231細(xì)胞活力。該結(jié)果進(jìn)一步說明miR-126作為三陰性乳腺癌分子靶標(biāo)的可行性。

本研究證實miR-126在體外具有抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞生長的能力，并且通過超聲微泡介導(dǎo)的miR-126進(jìn)一步增強(qiáng)了這種抑制作用。本研究的結(jié)果證明超聲微泡介導(dǎo)的miRNA是一種有效的基因療法。同時，也探究了miR-126對CRK的調(diào)控作用，當(dāng)然，miR-126的下游分子靶標(biāo)不止CRK，但是該研究為下一步探索miR-126的其他靶標(biāo)奠定了理論基礎(chǔ)，也為乳腺癌的臨床治療提供了理論支持。