榮 黎 李 桓 歐陽凈 王 麗 池祥波 陳耀凱

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心，重慶 400036)

自噬作為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，通過降解自噬成分清除蛋白質(zhì)異常聚集和受損細(xì)胞器調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，與多種疾病發(fā)生密切相關(guān)[1-3]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，細(xì)胞自噬呈“兩面性”，在腫瘤藥物治療中發(fā)揮不同作用[4-9]。

mTOR(mammalian target of rapamycin)是哺乳動物雷帕霉素的靶點(diǎn)，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)從而抑制自噬，是調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[10，11]。PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)作為腫瘤細(xì)胞中調(diào)控凋亡的經(jīng)典信號通路，同時也是mTOR的上游靶點(diǎn)，對于后者的激活起重要調(diào)控作用[12,13]。

本課題組前期功能實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)紅景天甙不僅能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且能誘導(dǎo)自噬[14]。LC3(light chain 3)是自噬發(fā)生發(fā)展過程中的重要標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平與自噬水平相對應(yīng)[15]。本研究聚焦于自噬，探討自噬在紅景天甙促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制,為進(jìn)一步研究紅景天甙在胃癌中的治療作用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株AGS由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈。

1.1.2試劑與儀器 紅景天苷(南京格爾狄生物科技有限公司)，1640培養(yǎng)基(美國Hyclone),胎牛血清(美國Gibco),IGF-1、氯喹(美國Sigma Aldrich)，Hoechst33342、AV/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京碧云天生物公司)，Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3b及Beclin-1抗體(上海abways technology)，腺病毒載體(上海Hansheng)，流式細(xì)胞儀(BD，Intra)，透射電鏡(Philips TECNAI20)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica TCS-SP2)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以不含紅景天甙的1640培養(yǎng)基作為對照組，以40 μmol/L紅景天甙處理的胃癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組;以10 μmol/L IGF-1和10 μmol/L氯喹(CQ)分別預(yù)處理胃癌細(xì)胞30 min作為干預(yù)組。

1.2.2Hoechst33342細(xì)胞核染色 細(xì)胞以1×105個/孔接種于含無菌玻片的24孔板，培養(yǎng)24 h，40 μmol/L 紅景天甙(或先經(jīng)10 μmol/L CQ預(yù)處理30 min)處理細(xì)胞48 h，PBS洗滌3次，500 μl 4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌3次，以PBS稀釋DAPI(1∶20)，200 μl/孔稀釋液常溫染色10 min，PBS洗滌3次，封片，正置熒光顯微鏡觀察。

1.2.3AV/PI流式細(xì)胞術(shù) 1×106個/孔AGS細(xì)胞接種至6孔板，培養(yǎng)24 h，加入40 μmol/L紅景天甙(或先經(jīng)10 μmol/L CQ預(yù)處理30 min)。48 h后收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌，懸浮于緩沖液中，Annexin V-FITC和PI室溫暗處染色 15 min，流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4Western blot 收集處理后的AGS細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌1次。100 μl預(yù)冷Western細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞后冰浴裂解30 min,4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品,Lowry法測定樣品蛋白濃度以確定上樣量。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入一抗和二抗,DAB顯色。室溫輕搖5 min后觀察蛋白條帶,待顯色清晰,轉(zhuǎn)入PBS中漂洗,ECL化學(xué)發(fā)光照相。

1.2.5透射電鏡 收集處理后的細(xì)胞PBS沖洗2次，2.5%戊二醛室溫固定90 min；1%四氧化鋨固定30 min。梯度脫水后，細(xì)胞被包埋、切片，飽和乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色；透射電鏡觀察雙膜自噬囊泡。

1.2.6mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染 收集1×104個處理好的細(xì)胞，置于激光共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿中。將10 μl 攜帶mRFP-GFP-LC3腺病毒載體與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照觀察熒光自噬斑點(diǎn)的數(shù)量與強(qiáng)弱。

2 結(jié)果

2.1紅景天甙誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬體形成 透射電鏡觀察結(jié)果表明，與對照組相比，紅景天甙組出現(xiàn)明顯的雙膜自噬囊泡(圖1)，說明紅景天甙成功誘導(dǎo)自噬體的形成。

圖1 透射電鏡觀察紅景天甙誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞形成雙膜自噬囊泡Fig.1 Formation of double membrane autophagy vesicles in AGS cells induced by salidroside was observed by transmission electron microscope

2.2紅景天甙增加熒光自噬斑點(diǎn)數(shù)量和強(qiáng)度 與對照組相比，紅景天甙組胃癌細(xì)胞胞漿內(nèi)熒光自噬斑點(diǎn)數(shù)量與強(qiáng)度均明顯上調(diào)(圖2)，證明紅景天甙能誘導(dǎo)AGS細(xì)胞自噬。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察紅景天甙對熒光自噬斑點(diǎn)的影響Fig.2 Effect of salidroside on number of fluorescence autophagic spots as determined by laser scanning confocal microscopy

2.3氯喹增加紅景天甙誘導(dǎo)的細(xì)胞核固縮 Hoechst33342染色結(jié)果顯示，紅景天甙處理細(xì)胞后細(xì)胞核染色質(zhì)固縮增加，自噬抑制劑氯喹預(yù)處理后，紅景天甙誘導(dǎo)的核固縮顯著增加，表明抑制自噬可促進(jìn)紅景天甙誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖3)。

圖3 Hoechst33342染色觀察AGS細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化Fig.3 Morphological changes of AGS cell apoptosis were observed by Hoechst33342 staining

2.4氯喹促進(jìn)紅景天甙誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，與對照組(4.5±0.7)%相比，紅景天甙組細(xì)胞凋亡率(13.7±0.9)%明顯提高，自噬抑制劑氯喹預(yù)處理后，紅景天甙的促凋亡效應(yīng)顯著增強(qiáng)(圖4)，凋亡率由(13.7±0.9)%上升為(25.2±1.2)%。表明抑制自噬可增強(qiáng)紅景天甙的促凋亡作用。

圖4 流式細(xì)胞檢測胃癌細(xì)胞凋亡數(shù)量Fig.4 Apoptosis number of gastric cancer cells was detected by flow cytometry

2.5氯喹紅景天甙對凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響 與對照組相比，紅景天甙下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase9表達(dá)。自噬抑制劑氯喹預(yù)處理后，紅景天甙誘導(dǎo)的促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)(圖5)。

圖5 Western blot檢測氯喹預(yù)處理對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of chloroquine on apoptosis-related protein expressions was detected by Western blot

2.6紅景天甙通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬 紅景天甙明顯抑制PI3K、AKT和mTOR活化，磷酸化PI3K蛋白、磷酸化AKT蛋白和磷酸化mTOR蛋白表達(dá)下調(diào)(圖6)。PI3K/AKT激動劑IGF-1干預(yù)處理后，自噬關(guān)鍵蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)降低(圖7),熒光自噬斑點(diǎn)的數(shù)量和強(qiáng)度明顯減弱(圖8)。表明激活mTOR上游調(diào)節(jié)通路PI3K/AKT可抑制自噬蛋白表達(dá)。

圖6 Western blot檢測紅景天甙對PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的影響Fig.6 Effect of salidroside on PI3K/AKT/mTOR pathway proteins was detected by Western blot

圖7 Western blot檢測IGF-1對自噬蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of IGF-1 on autophagy proteins expressions was detected by Western blot

圖8 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察IGF-1預(yù)處理對熒光自噬斑點(diǎn)表達(dá)的影響Fig.8 Effect of IGF-1 on expression of fluorescent autophagy spots was observed by laser scanning confocal microscope

3 討論

自噬是Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)“自己吃自己”現(xiàn)象后提出的概念，是必需的溶酶體降解過程，通過清除蛋白質(zhì)聚集物和受損細(xì)胞器控制細(xì)胞質(zhì)量[1]。自噬形成的雙膜自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進(jìn)而降低自噬成分，滿足細(xì)胞本身代謝需要和實(shí)現(xiàn)部分細(xì)胞器更新[2]。自噬對機(jī)體自我平衡具有重要調(diào)節(jié)作用，其降解作用與多種疾病密切相關(guān)，包括代謝失調(diào)、神經(jīng)病變、癌癥及感染性疾病等[3]。

自噬有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，應(yīng)激條件下，自噬可防止有毒或致癌的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器累積，防止細(xì)胞癌變。而腫瘤一旦形成，自噬則為癌細(xì)胞提供更豐富的營養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤生長[16]。因此，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞自噬的作用呈現(xiàn)完全相反的“兩面性”[17]。各種病理狀態(tài)下，自噬的作用到底是正向還是負(fù)向尚未完全闡明，尤其是腫瘤研究。研究表明，自噬在不同藥物治療腫瘤中發(fā)揮不同作用，可能增強(qiáng)藥物療效，也可能抑制藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[6-9,18]。因此，自噬作為調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長的重要機(jī)制值得重點(diǎn)關(guān)注。

mTOR在腫瘤細(xì)胞中通常表達(dá)上調(diào)從而抑制細(xì)胞自噬[10]。作為細(xì)胞自噬中眾多信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和最主要的抑制性通路，具有重要作用[11]。PI3K/AKT作為腫瘤細(xì)胞中調(diào)控凋亡的經(jīng)典信號通路，同時也是mTOR的上游靶點(diǎn)，前者對于后者的激活起重要作用[12,13]。因此，腫瘤細(xì)胞中自噬和凋亡關(guān)系密切。闡明紅景天甙誘導(dǎo)的自噬現(xiàn)象在其抑制胃癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡等眾多細(xì)胞表型中的作用及機(jī)制，將為胃癌防治新藥物開發(fā)提供參考。

本研究主要聚焦于自噬，探討自噬在紅景天甙促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用及相關(guān)機(jī)制。通過透射電鏡和mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染證實(shí)紅景天甙誘導(dǎo)AGS細(xì)胞自噬，利用經(jīng)典的自噬晚期抑制劑氯喹預(yù)處理細(xì)胞[19]。通過Hoechst染色、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot多角度提示抑制自噬可明顯促進(jìn)紅景天甙誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明自噬是細(xì)胞在外界攻擊因素作用下激發(fā)的自我保護(hù)性防御反射,與Wang等[9]研究結(jié)論相似。提示在后續(xù)研究中，可進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用紅景天甙和自噬抑制劑協(xié)同殺傷胃癌細(xì)胞。為進(jìn)一步闡明紅景天甙誘導(dǎo)AGS細(xì)胞自噬的機(jī)制，課題組通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅景天甙抑制磷酸化PI3K、磷酸化AKT以及磷酸化mTOR蛋白表達(dá)，利用IGF-1預(yù)處理細(xì)胞，通過Western blot和熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，激活mTOR的上游調(diào)節(jié)通路PI3K/AKT可降低自噬蛋白表達(dá)，提示紅景天甙可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)人胃癌AGS細(xì)胞自噬，與Fan等[20]結(jié)論一致。

紅景天甙作為植物類中藥在腫瘤防治中具有諸多優(yōu)勢，腫瘤研究初步顯示出其特有的抗癌效果，具備研究潛力。課題組后續(xù)將利用細(xì)胞、動物模型結(jié)合基因、蛋白組學(xué)并聯(lián)合生物信息學(xué)技術(shù)等手段對紅景天甙的抗癌作用進(jìn)行深入研究，為闡明紅景天甙防治腫瘤的機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)。