王子葉 楊 堃 溫大蔚 趙 磊 王吉波

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，青島 216000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜關(guān)節(jié)慢性炎癥為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性疾病[1]。近年研究提出巨噬細(xì)胞為RA病理生理核心炎癥細(xì)胞，涉及RA的各個階段，尤其是RA早期。巨噬細(xì)胞激活后產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子和趨化因子如腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)和IL-1β，導(dǎo)致RA炎癥過程[2]。對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制的探討有助于進(jìn)一步明確RA發(fā)病機(jī)制，探索新的治療靶點。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是長度在200 bp以上，不具備編碼蛋白功能的RNA[3]。許多證據(jù)表明lncRNAs參與機(jī)體的多種生物過程，包括炎癥反應(yīng)[4]。近年lncRNAs在風(fēng)濕免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、RA中的作用也引起眾多關(guān)注[3，5-7]。lncRNA 心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(lncRNA myocardial infarction associated transcript，lncRNA MIAT)是一種主要表達(dá)于心肌細(xì)胞和腎臟細(xì)胞、具有調(diào)控蛋白合成功能的lncRNA。Fagerberg等[8]利用芯片技術(shù)對人體組織和器官進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIAT在骨髓中高表達(dá)，說明骨髓是lncRNA MIAT的主要作用場所之一。此外，lncRNA MIAT在多種疾病的發(fā)生中扮演重要角色，主要與炎癥反應(yīng)的激活相關(guān)[9]。骨髓內(nèi)以單核巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤增加導(dǎo)致的骨髓水腫被認(rèn)為是RA的早期主要病理表現(xiàn)之一，且長期持續(xù)存在于RA各階段[10]。因而推測lncRNA MIAT可能與骨髓巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)進(jìn)而影響RA發(fā)病。本文旨在研究lncRNA MIAT在小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1中的作用及其可能作用的炎癥通路，為進(jìn)一步探究lncRNA MIAT在RA骨髓巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠來源巨噬細(xì)胞J774A.1(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國)；胎牛血清(fatal bovine serun,FBS;Gibco,美國);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS;Sigma，美國)；ERK5特異性抑制劑ERK5-IN-2(MCE，美國)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO；索萊寶，北京)；shNC/MIAT 質(zhì)粒(吉瑪基因，上海)；TRIzol，real time-qPCR試劑盒(TaKaRa，大連)；引物(華大基因，深圳)；核質(zhì)分離試劑盒(Invitrogen，美國)；PVDF膜(Millipore，德國)；BCA試劑盒(碧云天，中國)；RIPA(10X)、蛋白酶抑制劑Cocktail、GAPDH、NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3、磷酸化-NF-κB、磷酸化-ERK1/2、磷酸化-ERK5、磷酸化-STAT3一抗和HRP-山羊抗兔二抗(CST，美國)；ECL發(fā)光液(Thermo Scientific，美國)；小鼠來源IL-1β、TNF-αELISA試劑盒(eBioscience，美國)；LightCyclerTM480 Ⅱ qPCR儀(Roche，瑞士)；電泳轉(zhuǎn)膜設(shè)備、顯影儀、熒光酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型的制備 含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液用于培養(yǎng)小鼠來源巨噬細(xì)胞J774A.1，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時傳代，傳代比例1∶3。取生長狀態(tài)良好、對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

用100 ng/ml的LPS刺激J774A.1細(xì)胞制備炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型(LPS組)，以等體積PBS刺激的J774A.1細(xì)胞為對照組(PBS組)，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實驗。

在炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型中加入ERK5-IN-2作為抑制劑組，以ERK5-IN-2溶解液DMSO作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 預(yù)冷PBS物理吹打法解離對數(shù)生長期J774A.1細(xì)胞，以8×104～1×105個/孔均勻鋪于24孔板中，細(xì)胞密度達(dá)70%～90%時行脂質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染shMIAT質(zhì)粒為敲低(knock-down，KD)組，轉(zhuǎn)染shNC 質(zhì)粒為陰性對照(negative control，NC)組。

1.2.3分離提取細(xì)胞總RNA、細(xì)胞核質(zhì)DNA及RT-qPCR檢測 TRIzol法分別提取LPS組、PBS組、KD組、NC組、ERK5-IN-2組和DMSO組J774A.1細(xì)胞的總RNA。用核質(zhì)分離試劑盒對LPS組及PBS組的細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離，分別提取細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按SYBR Premix TaqⅡ試劑盒配制20 μl反應(yīng)體系：TB Green 10 μl、cDNA 2 μl、上游引物1.6 μl(5 μmol/L)、下游引物1.6 μl(5 μmol/L)、RNase free 水 4.8 μl。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個循環(huán)復(fù)性；94℃ 90 s、60℃ 180 s延伸，繪制擴(kuò)增曲線。以GAPDH為細(xì)胞總RNA及細(xì)胞質(zhì)RNA的內(nèi)參基因，U6為細(xì)胞核RNA的內(nèi)參基因，由2- ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取KD組、NC組、ERK5-IN-2組和DMSO組J774A.1細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒用于測定蛋白質(zhì)濃度。上樣緩沖液經(jīng)100℃變性10 min后行SDS-PAGE電泳(80 V 30 min，120 V 1 h)，轉(zhuǎn)膜(290 mA 90 min)，5% BSA封閉1 h，加GAPDH 抗體(1∶1 000)、NF-κB抗體(1∶1 000)、ERK 1/2抗體(1∶1 000)、ERK5抗體、STAT3抗體(1∶1 000)、p-NF-κB抗體(1∶2 000)、p-ERK1/2抗體(1∶2 000)、p-ERK5抗體(1∶2 000)、p-STAT3抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，10 min/次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的對應(yīng)種屬來源二抗(1∶5 000)，室溫?fù)u床孵育1 h后TBST漂洗3次，10 min/次，凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光顯色。

1.2.5ELISA檢測IL-1β、TNF-α含量 收集LPS組和PBS組細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測細(xì)胞上清IL-1β、TNF-α含量。

2 結(jié)果

2.1炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型的制備 LPS組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)分別為426.41±18.38、5.26±0.30，顯著高于PBS組(P<0.05)。LPS組細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α水平分別為(592.30±4.92)pg/ml、(433.70±14.62)pg/ml，顯著高于PBS組(P<0.05)。

2.2lncRNA MIAT 在LPS刺激J774A.1細(xì)胞的核質(zhì)表達(dá) lncRNA MIAT在LPS組的相對表達(dá)量顯著高于PBS組(P<0.05)，且主要表達(dá)于細(xì)胞核(圖1)。

圖1 lncRNA MIAT在LPS刺激的J774A.1細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA MIAT in LPS stimulated J774A.1 cells

2.3lncRNA MIAT在J774A.1細(xì)胞的敲低效率及其對IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)的影響 KD組IL-1β、TNF-α mRNA相對表達(dá)量顯著高于NC組(P<0.05)。見圖2。

圖2 敲低J774A.1細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MIAT表達(dá)Fig.2 Knocking down of lncRNA MIAT in J774A.1

2.4lncRNA MIAT對轉(zhuǎn)錄因子的影響 與NC組相比，KD組p-ERK5蛋白表達(dá)顯著提高 (P<0.05)；KD組p-NF-κB、p-STAT3、p-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.29)。見圖3。

圖3 lncRNA MIAT對轉(zhuǎn)錄因子磷酸化的作用Fig.3 Effect of lncRNA MIAT on transcription factors phosphorylation

2.5ERK5-IN-2對ERK5抑制效率及ERK5抑制后IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與DMSO對照組比，抑制劑組p-EKR5蛋白水平顯著降低(P<0.05)；IL-1β、TNF-α mRNA相對表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 ERK5磷酸化對IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of ERK5 phosphorylation on the expression of IL-1β and TNF-α mRNA.

3 討論

盡管RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，但隨著研究不斷深入，巨噬細(xì)胞在RA發(fā)病中的核心作用已得到廣泛認(rèn)可[2,11,12]。因此巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程及機(jī)制的研究對揭示RA發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。lncRNAs是細(xì)胞因子等功能性蛋白的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，在RA發(fā)病中的作用也被逐漸認(rèn)可[13]。lncRNA MIAT被證實參與多種疾病的發(fā)生，可能與機(jī)體的炎癥反應(yīng)有關(guān)[14]。由于lncRNA MIAT在骨髓中高表達(dá)，以單核巨噬細(xì)胞炎癥為主的骨髓水腫是RA早期的主要臨床表現(xiàn)之一[8,10]。因而，課題組猜測lncRNA MIAT可能通過參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)參與RA發(fā)病。本研究以小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1為研究對象，探討lncRNA MIAT是否參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)及其可能參與的炎癥通路。

研究發(fā)現(xiàn)，與PBS組相比，lncRNA MIAT在LPS組細(xì)胞顯著高表達(dá)，提示lncRNA MIAT參與了炎癥反應(yīng)過程，與既往研究提出的lncRNA MIAT參與炎癥反應(yīng)的結(jié)論一致[9]。結(jié)果還證實lncRNA MIAT亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞核，提示lncRNA MIAT主要發(fā)揮作用的部位可能在細(xì)胞核，但由于細(xì)胞質(zhì)中l(wèi)ncRNA MIAT表達(dá)也相對增多，因此不能排除其可在細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步探索lncRNA MIAT對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，課題組利用shMIAT敲低J774A.1細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MIAT的表達(dá)。結(jié)果顯示炎癥因子IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)，提示lncRNA MIAT在巨噬細(xì)胞中可能發(fā)揮抑制炎癥的作用，為巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的深入研究提供了新的對象。

NF-κB、STAT3等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的炎癥通路是巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的主要途徑[15]。NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3等多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化后入核，可在細(xì)胞核內(nèi)影響炎癥因子IL-1β、TNF-α轉(zhuǎn)錄[16-20]。lncRNAs可通過影響轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)控作用[21]。因此推測，lncRNA MIAT可能通過影響與炎癥通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑制炎癥的作用。本研究分別對KD組及NC組J774A.1細(xì)胞的多種轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、ERK1/2、ERK5、STAT3進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)ERK5磷酸化水平在lncRNA MIAT的KD組顯著高于NC組，提示lncRNA MIAT可能參與抑制ERK5磷酸化。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的J774A.1中加入ERK5特異性抑制劑ERK5-IN-2后，IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)明顯減少，表明ERK5磷酸化可促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，與既往研究提出的ERK5可通過促進(jìn)Toll樣受體2激活增強IL-1β、TNF-α表達(dá)的結(jié)論一致[20]。綜上所述，lncRNA MIAT可能通過抑制ERK5磷酸化通路減少IL-1β、TNF-α轉(zhuǎn)錄從而抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中具有負(fù)向調(diào)控作用。

雖然lncRNA MIAT可能通過抑制ERK5磷酸化炎癥通路來抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但在RA中l(wèi)ncRNA MIAT 與巨噬細(xì)胞炎癥是否存在確切關(guān)系需要通過收集臨床資料和動物實驗進(jìn)一步證明。機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，促炎因子大量釋放堆積，抑炎因子作用發(fā)生弱化。lncRNA MIAT抑制炎癥作用的發(fā)現(xiàn)，提示可以從促進(jìn)抑炎基因表達(dá)的角度探索治療以RA為代表的炎癥疾病的新方向。