陳 嵐，沈 娟，嚴(yán)萬年，范凌志，曹穎瑛 （. 空軍杭州特勤療養(yǎng)中心療養(yǎng)三區(qū)藥械科，浙江 杭州 3000；. 上海市皮膚病醫(yī)院，上海 00443）

近年來，隨著廣譜抗生素的使用、艾滋病病毒感染、腫瘤放療/化療以及器官移植患者的不斷增多，導(dǎo)管插管等越來越多的生物材料應(yīng)用于人體，侵襲性真菌感染的發(fā)病率顯著上升，對人類健康乃至生命造成嚴(yán)重威脅。在臨床真菌感染中，白假絲酵母（Candida albicans）是最常見的致病真菌之一[1]。研究表明，白假絲酵母能通過黏附于人上皮及植入的導(dǎo)管或支架等表面，形成生物被膜（biofilm），從而在免疫功能低下的人群中導(dǎo)致系統(tǒng)性感染。白假絲酵母生物被膜的一個(gè)嚴(yán)重后果是對臨床常用抗真菌藥物呈高度耐藥。與浮游型白假絲酵母相比，生物被膜型白假絲酵母對兩性霉素B、氟康唑的敏感性僅是浮游菌的幾十分之一。生物被膜形成是導(dǎo)致臨床上許多系統(tǒng)性、反復(fù)性感染的重要因素，是抗真菌感染治療失敗的主要原因之一[2-3]。因此，研究開發(fā)抗白假絲酵母生物被膜藥物對于抗真菌感染的治療具有重要意義。

山奈酚（kaempferol，KAE）又名山柰素、山柰黃酮醇，其分子結(jié)構(gòu)見圖1。山奈酚屬于黃酮類化合物，主要來源于姜科植物山柰的根莖。同時(shí)，該化合物廣泛存在于多種蔬菜及水果中。研究顯示，山奈酚具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集及抗病毒等多種生物學(xué)活性[4-6]。本文旨在研究山奈酚抗白假絲酵母生物被膜活性并探索其潛在作用機(jī)制，為臨床抗真菌感染提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、試劑和培養(yǎng)基

白假絲酵母國際通用株SC5314（C. albicansSC5314）由上海市皮膚病醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。山奈酚（美國Sigma 公司），二甲亞砜(DMSO，國藥化學(xué)試劑有限公司）。將山奈酚溶于DMSO 配制成母液，使用時(shí)以RPMI1640 稀釋至所需濃度。XTT（化學(xué)名：2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide）和甲萘醌試劑（美國Sigma 公司），分別用PBS、丙酮溶解配制成母液。真菌RNA 抽提試劑盒（北京天恩澤基因科技公司），RNA 反轉(zhuǎn)錄、PrimeScript RT Master Mix Perfect RealTime 及SYBR Premix ExTaqTM試 劑（TaKaRa 生物公司）。

沙氏固體培養(yǎng)基(SDA)：蛋白胨10 g,D-葡萄糖40 g，瓊脂粉20 g，以去離子水溶解并定容至1 000 ml，高壓滅菌（121 ℃，15 min），室溫冷卻凝固后備用。YPD 液體培養(yǎng)基：蛋白陳10 g，酵母提取物10 g，D-葡萄糖20 g，以去離子水溶解并定容至1 000 ml，分裝后高壓滅菌（121 ℃，15 min）備用。RPMI1640 液體培養(yǎng)基：將RPMI1640 粉末（Gibco BRL 公司）10 g，MOPS（涯泰生物科技公司）34.5 g，NaHCO32.0 g，以去離子水溶解并定容至1 000 ml，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0，定容至1 000 ml，微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存。

1.1.2 儀器

恒溫振蕩培養(yǎng)箱(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)，超凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning 公司），Infinite M200 多功能酶標(biāo)儀（Austria TECAN 公司），ABl7500 實(shí)時(shí)定量 RTPCR 儀(Applied Biosystems 公司)。

1.2 菌株活化

挑取白假絲酵母SC5314 甘油凍存菌劃于SDA 平板，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，待長出單克隆后，挑取菌株單克隆接種于新鮮YPD 液體培養(yǎng)基中，再于30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜（16 h），使其到達(dá)對數(shù)生長期后期。

1.3 山奈酚抗生物被膜形成實(shí)驗(yàn)

白假絲酵母生物被膜培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。離心收集上述培養(yǎng)基至對數(shù)生長后期的白假絲酵母菌液，PBS 洗滌3 次，重懸于RPMI1640 培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)菌液濃度為1×106CFU/ml。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100 μl 上述菌液，37 ℃靜置培養(yǎng)2 h，棄上清液，于各孔中分別加入100 μl含有不同濃度山奈酚的RPMIl640 培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h。

1.4 山奈酚抗成熟生物被膜實(shí)驗(yàn)

離心收集培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的白假絲酵母菌液，PBS 洗滌3 次，重懸于RPMI1640 培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)菌液濃度為1×106CFU/ml。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100 μl 上述菌液，37 ℃靜置培養(yǎng)2 h，棄上清液，于各孔中加入新鮮RPMIl640 培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h，棄上清液，PBS 洗滌2 次，于各孔中分別加入100 μl 含有不同濃度山奈酚的RPMIl640 培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h。

1.5 生物被膜代謝活性測定

取出上述培養(yǎng)的生物被膜，棄上清液，PBS 洗2 次，隨后加入200 μlXTT-甲萘醌溶液（含有0.5 mg/ml XTT-1 μmol/L 甲萘醌），于37 ℃黑暗處靜置孵育2 h 后取出。采用多功能酶標(biāo)檢測儀于492 nm處測定光密度（OD）值。

1.6 生物被膜基質(zhì)含量測定

生物被膜基質(zhì)（biomass）含量測定參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行。在預(yù)先放置有硅膠片（1.5 cm×1.5 cm，美國Bentec 醫(yī)藥公司）的12 孔培養(yǎng)板中，每孔加入2 ml 白假絲酵母菌液（1×106CFU/ml 于RPMI1640培養(yǎng)基中），黏附2 h，棄上清液，加入含有不同濃度山奈酚的新鮮RPMI1640 培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h，棄上清液，PBS 洗滌2 次，于各孔中分別加入100 μl 含有不同濃度山奈酚的RPMIl640 培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h，取出上述培養(yǎng)的生物被膜，棄上清液，PBS 洗2 次，晾干至恒重并稱重，所得重量減去硅膠片本身質(zhì)量即為生物被膜基質(zhì)量。

1.7 菌絲形成抑制實(shí)驗(yàn)

將過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的白假絲酵母，于次日按照1%接種于新鮮YPD 液體培養(yǎng)基，30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，PBS 洗滌2 次，重懸于含有16 μg/ml的山奈酚YPD+FBS 培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清），調(diào)整菌濃度為l×l06CFU/ml，于細(xì)胞培養(yǎng)板中37 ℃靜置培養(yǎng)3.5 h，顯微鏡下觀察白假絲酵母菌絲形成情況。

1.8 細(xì)胞表面疏水性測定

采用水-烴兩相分離法測定細(xì)胞表面疏水性[9]。將過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的白假絲酵母于次日按照1%量接種于新鮮YPD 液體培養(yǎng)基，30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，隨后加入不同濃度山奈酚，于30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，離心收集菌液以PBS 洗滌2 次，重懸于YPD 液體培養(yǎng)基，調(diào)整菌液至OD600=1.0，每組取1.2 ml 菌懸液于另一離心管中，加入0.3 ml 正辛烷，渦旋振蕩混勻3 min，室溫靜置使兩相分離，立即測定上層水相的OD600值，以未加正辛烷的YPD 培養(yǎng)基為陰性對照。白假絲酵母細(xì)胞表面疏水性值的計(jì)算公式：相對細(xì)胞表面疏水性=[(OD600對照組-OD600實(shí)驗(yàn)組)/OD600對照組]×100%。

1.9 引物設(shè)計(jì)

應(yīng)用Primer Premier5 軟件設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)定量RT-PCR 擴(kuò)增的目的基因引物序列（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.10 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的白假絲酵母菌液，PBS 洗滌3 次，重懸于RPMI1640 培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)菌液濃度為l×l06CFU/ml。將上述菌液在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中37 ℃靜置培養(yǎng)2 h，棄上清液，隨后加入含有16 μg/ml 山奈酚的新鮮RPMIl640 培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h。離心收集菌體，PBS 洗滌3 次，按照北京天恩澤基因科技公司真菌RNA 抽提試劑盒的操作說明進(jìn)行總RNA 的抽提，抽提完畢后加入100 μl 去除RNA 酶的水（經(jīng)DEPC 處理）溶解RNA，采用分光光度計(jì)測定RNA 純度及含量，A260/A280比 值 在1.8～2.0 之 間 為 合 格。按 照TaKaRa 生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將上述RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以18S rRNA 作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，30 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃，5 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s。溶解曲線采用60～95 ℃，溫度改變速率為每秒0.1 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI 7 500 SDS 軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。采用2-(⊿⊿Ct)法表示基因表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以(±s)表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，以P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 山奈酚抑制白假絲酵母生物被膜的形成

以不同濃度的山奈酚作用于白假絲酵母生物被膜形成早期（黏附2 h），于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后測定生物被膜代謝活性。XTT 測定結(jié)果顯示：山奈酚可抑制白假絲酵母生物被膜形成，且呈劑量依賴性。當(dāng)山奈酚濃度為8 μg/ml 時(shí)，生物被膜形成被明顯抑制。當(dāng)32 μg/ml 的山奈酚作用于生物被膜時(shí)，其代謝活性約為對照組的35%，經(jīng)128 μg/ml的山奈酚處理的白假絲酵母幾乎不能形成生物被膜（圖2A）。

由于生物被膜基質(zhì)含量是顯示白假絲酵母生物被膜形成能力的一個(gè)重要特征，我們進(jìn)一步考察了山奈酚對生物被膜基質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明：與對照組相比，經(jīng)山奈酚處理的生物被膜基質(zhì)含量顯著下降，呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)32 μg/ml 的山奈酚作用于白假絲酵母生物被膜時(shí)，其基質(zhì)產(chǎn)生量不足對照組的50%（圖2B）。

2.2 山奈酚抗成熟白假絲酵母生物被膜活性

將不同濃度的山奈酚作用于成熟白假絲酵母生物被膜（培養(yǎng)24 h），于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后測定生物被膜代謝活性。結(jié)果顯示：16 μg/ml 的山奈酚具有明顯的抗成熟生物被膜活性。當(dāng)32 μg/ml的山奈酚作用于成熟生物被膜時(shí)，其代謝活性約為對照組的60%，經(jīng)128 μg/ml 的山奈酚處理的白假絲酵母生物被膜活性約為對照組的28%（圖3）。

2.3 山奈酚對白假絲酵母菌絲形成的影響

由于白假絲酵母菌絲形成能力與生物被膜密切相關(guān)，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察山奈酚對菌絲形成的影響。未加藥的對照組白假絲酵母在含有10%胎牛血清的YPD 培養(yǎng)基中可以形成正常菌絲，而當(dāng)16 μg/ml 的山奈酚作用于白假絲酵母時(shí)，菌絲生長受到明顯抑制，主要以酵母型菌生長（圖4）。

2.4 山奈酚對白假絲酵母細(xì)胞表面疏水性的影響

黏附是白假絲酵母生物被膜形成的早期關(guān)鍵步驟，而細(xì)胞表面疏水性對黏附具有重要影響，因此，本實(shí)驗(yàn)考察山奈酚對白假絲酵母細(xì)胞表面疏水性的影響。與對照組相比，4 μg/ml 的山奈酚對白假絲酵母細(xì)胞表面疏水性無明顯影響，而當(dāng)山奈酚的作用濃度為8 μg/ml 時(shí)，其細(xì)胞表面疏水性明顯下降，且呈現(xiàn)劑量依賴性（圖5）。

2.5 山奈酚對白假絲酵母生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由于山奈酚可以影響白假絲酵母菌絲形成及細(xì)胞表面疏水性，因此，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量RTPCR 法測定山奈酚對白假絲酵母菌絲形成及細(xì)胞表面疏水性相關(guān)基因表達(dá)的影響。如圖6 所示，經(jīng)16 μg/ml 山奈酚處理的白假絲酵母生物被膜中菌絲形成相關(guān)基因BCR1、NRG1和TUP1的基因表達(dá)分別升高了2.7、2.4 和3.9 倍，HWP1、EFG1和CPH1基因表達(dá)顯著下降，同時(shí)，細(xì)胞表面疏水性相關(guān)基因ALS1、ALS3和CSH1的表達(dá)明顯下降。

3 討論

近年來，隨著免疫低下人群的不斷增多以及越來越多的醫(yī)療器材應(yīng)用于人體，真菌感染率大幅增加，其中，以生物被膜型白假絲酵母感染較為常見，常導(dǎo)致反復(fù)性感染及耐藥，是臨床抗感染治療的一個(gè)重要難題。因此，尋找開發(fā)具有抗生物被膜活性的化合物對于防治真菌感染具有重要意義。

天然化合物作為藥物的一個(gè)重要組成部分，被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療。山奈酚是最常見的膳食類黃酮化合物之一，廣泛存在于花菜、茶葉及柚子等多種植物中，具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性。Shao 等報(bào)道山奈酚具有抗浮游型真菌活性并抑制耐藥相關(guān)外排泵基因的表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山奈酚具有抗白假絲酵母生物被膜活性，不僅可以抑制生物被膜形成，對于成熟生物被膜也有抑制作用。研究表明，白假絲酵母生物被膜基質(zhì)中富含碳水化合物及DNA，可以通過形成物理屏障阻礙抗真菌藥物進(jìn)入胞內(nèi)，因此，其含量與耐藥程度密切相關(guān)。有報(bào)道稱，生物被膜基質(zhì)可以隔離放射性標(biāo)記的氟康唑，將兩性霉素B 作用于去除基質(zhì)的念珠菌生物被膜，其抗菌活性與為去除基質(zhì)的對照組相比明顯增強(qiáng)[11-13]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)山奈酚處理的白假絲酵母生物被膜基質(zhì)水平明顯下降，這可能是該化合物發(fā)揮抗生物被膜活性的機(jī)制之一。

白假絲酵母生物被膜主要由3 部分構(gòu)成，即基底芽生孢子層、菌絲成分以及細(xì)胞外多聚基質(zhì)，其中，菌絲成分是構(gòu)成完整生物被膜的重要元件，酵母態(tài)到菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)換是其形成生物被膜的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山奈酚可以明顯抑制白假絲酵母菌絲形成。進(jìn)一步的實(shí)時(shí)定量RT-PCR 測定結(jié)果表明，山奈酚對菌絲形成相關(guān)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。HWP1是菌絲特異性表達(dá)基因，該基因缺失型生物被膜極易從附著物上脫落[14]。山奈酚對生物被膜的抑制作用可能與其下調(diào)HWP1基因表達(dá)有關(guān)。同時(shí)，經(jīng)山奈酚處理的白假絲酵母中2 個(gè)調(diào)控菌絲形成信號通路的重要轉(zhuǎn)錄因子EFG1和CPH1的表達(dá)也明顯下降。TUP1編碼的轉(zhuǎn)錄因子對菌絲形成具有抑制作用，可抑制菌絲形成相關(guān)基因的表達(dá)。有研究報(bào)道，TUP1敲除型白假絲酵母即使在適于酵母菌生長條件下也表現(xiàn)為菌絲過度生長[15]。在白假絲酵母菌絲及生物被膜形成抑制劑farnesol 處理的白色念珠菌中，TUP1基因呈過度表達(dá)[7]。NRG1是另一菌絲生長抑制型轉(zhuǎn)錄因子，在菌絲誘導(dǎo)條件下其mRNA 和蛋白表達(dá)水平均下降，該過程依賴cAMP/PKA 信號通路。NRG1對菌絲形成具有極強(qiáng)的抑制作用，可與TUP1共同抑制菌絲形成[16-18]。本實(shí)驗(yàn)中，TUP1和NRG1在山奈酚處理組中呈現(xiàn)高表達(dá)與菌絲形成抑制的生物學(xué)表型相一致。

白假絲酵母生物被膜的形成分為起始黏附、微克隆形成以及生物被膜成熟3 個(gè)階段，其中，細(xì)胞表面疏水性與起始黏附密切相關(guān)，對于正常生物被膜的形成至關(guān)重要[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)山奈酚處理的白假絲酵母細(xì)胞表面疏水性明顯下降。與此相一致的是，細(xì)胞表面疏水性相關(guān)基因CSH1的表達(dá)在山奈酚處理組中明顯下降。已有研究表明，ALS 家族基因在促進(jìn)白假絲酵母黏附及生物被膜的形成中發(fā)揮重要作用[20]。本實(shí)驗(yàn)中，該家族中的ALS1 和ALS3 基因在山奈酚處理組中表達(dá)下降。文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子BCR1 位于ALS1 和ALS3 基因上游，參與調(diào)控白假絲酵母的黏附及生物被膜形成。與ALS1 和ALS3 基因下調(diào)相反，本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)山奈酚處理的白假絲酵母中BCR1基因表達(dá)升高，提示山奈酚可能通過不依賴于BCR1的其他信號通路來調(diào)控ALS1 和ALS3 基因的表達(dá)[21]。綜上所述，山奈酚可能通過抑制白假絲酵母的黏附和菌絲形成從而發(fā)揮抗生物被膜作用。

綜上所述，本研究首次揭示了山奈酚的體外抗白假絲酵母生物被膜活性，其作用機(jī)制可能與抑制白假絲酵母菌絲形成和降低其細(xì)胞表面疏水性相關(guān)，這為治療臨床真菌生物被膜相關(guān)感染提供了新思路。