張 潔，張大為*，田永航

（海南熱帶海洋學院 海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心，海南 三亞 572022）

白貝（Monetaria moneta）別名貝子、貝齒、白海肥、白貝齒等，貝殼略呈扁圓形，表面光滑，氣微、味咸，含有鍶、磷、鈦等多種微量元素，其營養(yǎng)豐富，味道鮮美。白貝價格低廉，同時是一種高營養(yǎng)、低熱能的理想食物，深受消費者的喜愛，主要分布于我國南海海域[1-2]。白貝作為鮮活食材，目前主要以簡單烹調(diào)為主，市售白貝常出現(xiàn)死亡、腐敗等現(xiàn)象，不僅資源浪費，而且容易出現(xiàn)食品安全事故。將白貝進行深加工，不僅能解決上述問題，而且還可以增加產(chǎn)品附加值，是促進養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的有效途徑。

目前，我國調(diào)味品基本還處于以傳統(tǒng)谷氨酸鈉味精和復合化學調(diào)味料為主的階段，而如海產(chǎn)品發(fā)酵調(diào)味品這樣的復合天然調(diào)味料卻不多[3-5]。比如傳統(tǒng)的發(fā)酵魚露風味優(yōu)良、營養(yǎng)豐富，但它目前也還只在沿海地區(qū)被人們熟知，要走到更多家庭的餐桌上，還需要一段路程，改善其風味，優(yōu)化其工藝，是像魚露這樣傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品必經(jīng)的歷程。所以，針對傳統(tǒng)調(diào)味品發(fā)酵周期長等問題，眾多研究者開始關(guān)注速釀調(diào)味品[6-8]。但國內(nèi)還沒有充分認識到海產(chǎn)品天然調(diào)味品的價值，市場潛力未得到充分發(fā)掘。由于人們?nèi)狈μ烊徽{(diào)味品的認識，嚴重制約了我國調(diào)味品行業(yè)的發(fā)展。我國調(diào)味品產(chǎn)品單一，基本處于初級加工階段，早已不符合人們及市場對產(chǎn)品深加工的要求[9]。如今的企業(yè)競爭激烈，只有不斷創(chuàng)新、優(yōu)化產(chǎn)品和工藝，才能給調(diào)味品行業(yè)帶來源源不斷的活力。極大的市場要求，無疑是發(fā)酵調(diào)味品攻占市場的重要機遇。發(fā)酵調(diào)味品是以動、植物為原料，通過微生物發(fā)酵而得到的一類味道獨特的調(diào)味品，其香味成份非常復雜，其香味成分也根據(jù)原材料的不同而異[10-12]。

本試驗以白貝為原料，采用自然發(fā)酵方式得到一種發(fā)酵調(diào)味液，并通過單因素試驗和響應面試驗對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，為白貝產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白貝、食用鹽：三亞市旺豪超市；pH緩沖劑、氫氧化鈉（分析純）：西隴科學股份有限公司；結(jié)晶紫中性膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、緩沖葡萄糖煌綠膽鹽肉湯培養(yǎng)基：廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DPX-9082B-1型生化培養(yǎng)箱：金壇市盛藍儀器制造有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；ME204E型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PB-10型pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SQ510C型高壓蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 白貝自然發(fā)酵調(diào)味液制備工藝流程及操作要點

白貝→原料處理→烘干、打漿→加入食鹽→發(fā)酵→過濾→滅菌→成品

操作要點：

白貝：選取新鮮白貝，加入0.9%的食鹽水浸泡2 h。

原料處理：將白貝去殼，取肉，去砂，洗凈。

烘干、打漿：將洗凈的白貝肉，均勻分開攤平在鐵盤里，然后放入烘干箱，烘干溫度為35～55 ℃，烘干時間為20～60 min，且每隔10 min將白貝肉翻轉(zhuǎn)一次。將烘干到一定程度的白貝肉放入打漿機中打漿，備用。

加入食鹽：在白貝肉漿中加入10%～30%的食鹽，混勻，裝罐密封。

發(fā)酵：將添加食鹽的白貝漿在35～55 ℃的培養(yǎng)箱中發(fā)酵5～25 d。

過濾：將發(fā)酵好的白貝漿取出，用四層滅菌紗布過濾。

滅菌：將濾液在121 ℃、20 min條件下滅菌。

1.3.2 白貝自然發(fā)酵調(diào)味液制備工藝優(yōu)化單因素試驗

根據(jù)預試驗，確定基礎(chǔ)發(fā)酵條件為：取一定量的白貝經(jīng)過預處理，烘干溫度為45 ℃，烘干時間為40 min，食鹽添加量為15%，發(fā)酵溫度為45 ℃，發(fā)酵時間為15 d。制得成品后，以氨基酸態(tài)氮含量結(jié)合感官評分為評價指標，對調(diào)味液進行評價。考察不同烘干溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、烘干時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、食鹽添加量（10%、15%、20%、25%、30%）、發(fā)酵溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、發(fā)酵時間（5 d、10 d、15 d、20 d、25 d）對氨基酸態(tài)氮含量和感官評分的影響。

1.3.3 白貝自然發(fā)酵調(diào)味液制備工藝優(yōu)化響應面試驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken試驗設(shè)計，在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取食鹽添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）以及各自合適的水平，以氨基酸態(tài)氮含量（Y）為響應值，+1，0，-1分別代表著高、中、低3個水平，進行3因素3水平的試驗，試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 感官評價

選取10名有感官評價經(jīng)驗的食品專業(yè)人員進行測評，取適量樣品，在自然光下觀察其色澤，狀態(tài)，并聞其氣味，按照國標GB 2717—2018《食品安全國家標準 醬油》[13]感官評分標準打分，最后取各項平均值之和作為總分，滿分100分，白貝自然發(fā)酵調(diào)味液感官評定標準見表2。

表2 白貝自然發(fā)酵調(diào)味液感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standards of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

1.3.5 測定方法

氨基酸態(tài)氮含量的測定參照GB 2009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的酸度計法[14]；總酸的測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法[15]；總氮的測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法[16]；pH的測定參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》中均質(zhì)化試樣pH值的測定方法[17]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和作圖采用Origin 8.5，使用Design-Expert 8.0.6進行響應面設(shè)計。每個試驗重復3次，所有試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均為：平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 烘干溫度對調(diào)味液品質(zhì)的影響

圖1 烘干溫度對白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of drying temperature on quality of natural fermentation sauce from Monetaria moneta

由圖1可知，調(diào)味液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評分都隨著烘干溫度在35～55 ℃范圍內(nèi)的增加，呈先增加后減少的趨勢。烘干溫度為35 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量和感官評分均為最低，此時發(fā)酵香氣一般，液體出現(xiàn)部分渾濁，但色澤均勻，烘干溫度太低，白貝含水量過高，導致發(fā)酵過程中雜菌的過度繁殖，此時感官評分為64分，氨基酸態(tài)氮含量為0.54 g/100 g。隨著烘干溫度的逐漸升高，氨基酸態(tài)氮和感官評分均逐漸增加，烘干溫度為50 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量和感官評分均達到最高，此時發(fā)酵液色澤均勻，質(zhì)地均一、無雜質(zhì)，發(fā)酵香氣較好，感官評分為75分，氨基酸態(tài)氮含量為0.68 g/100 g，之后氨基酸態(tài)氮含量和感官評分均下降。故最適烘干溫度為50 ℃。

2.1.2 烘干時間對調(diào)味液品質(zhì)的影響

圖2 烘干時間對白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of drying time on the quality of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

由圖2可知，隨著烘干時間在20～60 min范圍內(nèi)的增加，氨基酸態(tài)氮和感官評分呈先增加后降低的趨勢，烘干時間為30 min時，調(diào)味液品質(zhì)最好，此時氨基酸態(tài)氮含量和感官評分均達到最高，分別為0.65 g/100 g、78分，此時調(diào)味液色澤均一，發(fā)酵香氣較好。烘干時間的長短決定調(diào)味液中水分含量，從而決定微生物和酶的活性。故白貝清洗后最適烘干時間為30 min。

2.1.3 食鹽添加量對調(diào)味液品質(zhì)的影響

圖3 食鹽添加量對白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of salt addition on the quality of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

由圖3可知，隨著食鹽添加量在10%～30%范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評分先增加后減少。食鹽添加量為15%時，氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.7 g/100 g，此時發(fā)酵香氣濃郁，發(fā)酵液有光澤，感官評分最高，為81分。食鹽添加量在10%時，由于過低的鹽分不足以抑制雜菌，使得白貝勻漿中的氨基酸態(tài)氮被消耗[18]，此時感官評分最低，為65分，氨基酸態(tài)氮含量為0.65 g/100 g，當食鹽添加量＞15%時，感官評分和氨基酸態(tài)氮指標逐漸下降。故最適食鹽添加量為15%。

圖4 發(fā)酵溫度對白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

2.1.4 發(fā)酵溫度對調(diào)味液品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度在35～55 ℃范圍內(nèi)的增加，發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評分先增加后減少。發(fā)酵溫度為35 ℃時，氨基酸態(tài)氮和感官評分都為最低值，此時，發(fā)酵液色澤暗淡，發(fā)酵香氣淡，液體出現(xiàn)渾濁，感官評分為45分。當發(fā)酵溫度為50 ℃時，發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評分均達到最高值，此時，發(fā)酵液色澤均勻，有光澤，發(fā)酵香氣濃郁，且無雜質(zhì)，感官評分為達80分，氨基酸態(tài)氮為0.65 g/100 g。調(diào)味液的氨基酸態(tài)氮含量和感官評分在發(fā)酵溫度50 ℃后均下降。結(jié)果表明，提高發(fā)酵溫度可以促進肉類組織的分解和溶出，有助于提高發(fā)酵液中的氨基酸態(tài)氮含量。但過高的發(fā)酵溫度，又會使蛋白質(zhì)活性降低，同時高溫讓發(fā)酵液中的鮮味與甜味氨基酸減少，苦味氨基酸含量增加，直接影響感官評分[20]。發(fā)酵溫度過低，氨基酸態(tài)氮含量低，表明白貝肉未完全分解，可能是因為低溫抑制了蛋白酶的活性而導致發(fā)酵不完全。故最適發(fā)酵溫度為50 ℃。

2.1.5 發(fā)酵時間對調(diào)味液品質(zhì)的影響

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間在5～25 d范圍內(nèi)增加，發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加后趨于平穩(wěn)，感官評分先增加后減少。發(fā)酵時間為5 d時，氨基酸態(tài)氮含量和感官評分均為最低，此時發(fā)酵液色澤暗淡，發(fā)酵香氣淡，出現(xiàn)渾濁，過短的發(fā)酵時間，白貝勻漿還未發(fā)酵完全，發(fā)酵時間為15 d時，發(fā)酵液發(fā)酵香氣濃郁，質(zhì)地均勻有光澤，感官最好，為82分，氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.7 g/100 g，而15 d后，發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量基本保持不變。故最適發(fā)酵時間為15 d。

圖5 發(fā)酵時間對白貝自然發(fā)酵調(diào)味液品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of naturally fermented sauce from Monetaria moneta

2.2 制備工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，固定烘干溫度50 ℃，烘干時間為30 min，選取對結(jié)果影響較大的3個因素食鹽添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C），以氨基酸態(tài)氮含量（Y）為響應值，進行3因素3水平的試驗，Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表3，方差分析見表4。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization

用Design-Expert 8.0.6對表3結(jié)果進行分析，得到回歸方程如下：

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型的P＜0.000 1說明該模型為極顯著，失擬項的P=0.144 4＞0.05，不顯著，表明試驗結(jié)果誤差小。決定系數(shù)R2=0.991 3＞0.8，表明模型擬合效果好，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=1.91%＜10%，表明該試驗的精確度和可信度都很高，綜上數(shù)據(jù)分析表明，該模型是可靠的。一次項A、交互項AB、二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應面分析

三維響應面和等高線是回歸函數(shù)的圖形表示，反映了兩個變量之間的相互作用及響應值與各變量試驗水平之間的關(guān)系。越接近橢圓形的等高線，其交互作用越是顯著，而越接近圓形，說明其交互作用越不明顯，等高線最小橢圓的中心點，是三維響應曲面的最高點，就是所選范圍內(nèi)存在的極值。食鹽添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）對氨基酸態(tài)氮含量（Y）影響的響應面及等高線見圖6。

由圖6a可知，當發(fā)酵時間一定時，鹽分與發(fā)酵溫度的交互作用顯著，由響應曲面圖看出，響應曲面存在最高點，該范圍內(nèi)存在極值，該極大值出現(xiàn)在發(fā)酵溫度49 ℃左右，鹽分在14%左右。由圖6b可看出，當發(fā)酵溫度一定時，鹽分與發(fā)酵時間的交互作用極顯著，響應曲面存在最高點，則該范圍內(nèi)存在極值，最大值出現(xiàn)在鹽分為14%左右，發(fā)酵時間為15 d左右。由圖6c可知，當鹽分一定時，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間的交互作用顯著，從響應曲面圖看出，圖形存在最高點，該范圍存在極值，最大值存在于發(fā)酵溫度為50 ℃左右，發(fā)酵時間在15 d左右。

圖6 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及食鹽添加量交互作用對白貝自然發(fā)酵調(diào)味液氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,time and salt addition on amino acid nitrogen contents of naturally fermentation sauce from Monetaria moneta

由軟件分析直接得出最佳發(fā)酵條件為：食鹽的添加量為14.04%，發(fā)酵溫度為50.09 ℃，發(fā)酵時間為16.38 d，軟件預測氨基酸態(tài)氮含量為0.728 g/100 g。根據(jù)此分析結(jié)果，為了便于實際操作，將發(fā)酵條件修正為：食鹽的添加量為14%，發(fā)酵溫度為50 ℃，發(fā)酵時間為16 d進行驗證試驗，得到發(fā)酵調(diào)味液氨基酸態(tài)氮含量實際值為（0.723±0.01）g/100 g，與預測結(jié)果接近，證明試驗分析可靠。

2.3 理化指標測定結(jié)果

經(jīng)過單因素和響應面試驗的優(yōu)化，最終成品發(fā)酵調(diào)味液的總酸含量為（35.28±0.03）g/L，氨基酸態(tài)氮含量為（0.723±0.01）g/100 g，pH值為5.43±0.02，總氮含量為（1.02±0.01）g/100 g。

3 結(jié)論

通過單因素和響應面試驗分析，得到了白貝發(fā)酵調(diào)味液的最佳制備工藝條件為：食鹽添加量14%，烘干溫度50 ℃，烘干時間30 min，發(fā)酵溫度為50 ℃，發(fā)酵時間為16 d。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液總酸含量為（35.28±0.03）g/L，氨基酸態(tài)氮含量為（0.723±0.01）g/100 g，總氮含量為（1.02±0.01）g/100 g，pH值為5.43±0.02。