黃婷婷，雷學俊，張文學，吳正云*

（1.四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都 610065；2.五糧液集團有限公司，四川 宜賓 644000）

曲是以糧谷為原料，經(jīng)微生物繁殖后，具有糖化、液化、發(fā)酵能力的生物制劑，是酒、食醋、醬油等傳統(tǒng)釀造中至關重要的發(fā)酵劑[1]。早在北魏時期就有在制曲時加入中草藥的記載，制曲入藥有增加風味、促進有益制曲微生物生長和抑制雜菌的作用[2]。根據(jù)曲的品種，添加藥材的種類和用量通常不同，如寧波白藥在制曲時加入1種中藥材；桂林三花小曲添加約10種中草藥；四川邛崍米曲加入大量中藥材；董酒的小曲加入71種，大曲加入40種中藥材[3-4]?，F(xiàn)代微生物發(fā)酵過程研究表明，微生物菌群具有氧化、酯化、甲基化、還原化等多種生物轉化能力[5-7]。微生物代謝過程中能夠產(chǎn)生大量的酶分解利用中藥材，中藥材經(jīng)過微生物的發(fā)酵，活性成分能得到充分的分離和提取，更易被機體吸收而發(fā)揮其生物活性，從而更好地發(fā)揮天然中草藥的藥效。

目前，中藥材對曲中有益菌生長代謝所起作用的探究僅局限于中藥材對酵母菌和根霉的影響，王世強等[8]的研究表明，人參含量的增加會使酵母菌的數(shù)量增加，人參對根霉菌絲的生長和淀粉酶活力提高有一定的刺激作用。周恒剛研究了8種中藥材對酵母菌生長的影響，結果表明陳皮、甘草、香附子對酵母生長及酒精生成都有明顯促進作用；杏仁、肉桂、良姜效果不明顯；柴胡、茯苓具有抑制作用[4]。

本實驗室前期研究了制曲藥材的選擇規(guī)律，藥材制作純種米曲的性能，但對藥材成分對米曲霉生長代謝的作用規(guī)律探究較少[9-10]。選擇常用的20種制曲中藥材為原料，通過不同的提取方法進行提取，用于米曲霉的生長試驗，探究中草藥及其提取成分對米曲霉生長和淀粉水解能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石菖蒲、天門冬、茯苓、蒼術、黃精、紅景天、西洋參、地黃、川烏、木香、牛膝、麥冬、黃芪、人參、何首烏、辣蓼、菊花、杏仁、枸杞、當歸：成都市武侯區(qū)同仁堂藥店。

米曲霉（Aspergillus oryzae）QJ：四川大學食品生態(tài)工程與生物技術研究室保藏。

無水乙醇、無水乙醚、苯酚、硫酸、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、香草醛、冰乙酸、高氯酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑公司；福林酚（Folin-Ciocalte）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。

無機鹽淀粉培養(yǎng)基：硝酸鉀0.2%，硫酸亞鐵0.01%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.05%，可溶性淀粉2%，瓊脂2%，pH自然。

1.2 儀器與設備

UV-2450型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；CW240小型中藥粉碎機：山東臨清宏源制藥設備有限公司；KQ5200DB超聲波清洗機：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋：上海申順生物科技有限公司；FA2004B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；101-1型電熱鼓風恒溫干燥箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化及培養(yǎng)

在無菌條件下，從種斜面上刮取適量米曲霉孢子接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，即活化。

用無菌水水洗已活化的米曲霉PDA試管斜面培養(yǎng)基以制備孢子懸液，再將孢子懸液稀釋至適宜梯度，涂布于已滅菌的PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，待整個平板中長滿白色菌絲后，于4 ℃保藏備用。

1.3.2 中藥材及其提取

采用蒸餾水、乙醇、乙醚三種溶劑對中藥材進行提取。

蒸餾水提：中藥材干燥粉碎后過40目篩，取10 g加入200 mL冷水浸泡60 min，煮沸后保持微沸60 min，4層紗布過濾，使濾液濃度為0.2 g/mL，于4 ℃保藏備用[11]。

乙醇、乙醚：取10 g粉碎中藥材，加入100 mL 體積分數(shù)80%的乙醇（乙醚），浸泡48 h，25 ℃、200 W超聲30 min后用4層紗布過濾，收集濾液后重復上述過程再提取一次，合并兩次濾液，將濾液旋轉蒸發(fā)濃縮至50 mL，得到中藥材0.2 g/mL的藥液，于4 ℃保藏備用[12]。

1.3.3 測定方法

總糖測定：采用苯酚硫酸法[13]；還原糖測定：采用DNS比色法[14]；總酚含量測定：采用Folin-Ciocalte法[15]；總黃酮含量測定：參考QUTTIER-DELEU C等的方法[16]；總皂苷含量測定：參考彭維等[17]的方法。

米曲霉的生長試驗：將15 mL無機鹽淀粉培養(yǎng)基和20%的藥材提取液裝入試管，以不加中草藥提取液的無機鹽淀粉培養(yǎng)基為空白，121 ℃滅菌20 min后倒入直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，待平板凝結后，接入采用直徑為5 mm的打孔器打取1.3.1培養(yǎng)好的米曲霉菌落，于28 ℃培養(yǎng)72 h，利用碘-淀粉比色法制得透明圈，采用十字交叉法量定菌落直徑和透明圈直徑，并計算透明圈直徑與菌落直徑之比值（transparent circle diameter/colony diameter，H/C值），其中，菌落直徑表征的是米曲霉的生長情況，透明圈直徑表征的是米曲霉對淀粉的水解能力，H/C表征的是單位米曲霉淀粉水解能力。每個樣品做3個平行實驗。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑對20種藥材提取液成分的影響

20種藥材的蒸餾水、乙醇、乙醚提取液的化學成分測定結果見圖1。

圖1 20種中藥材蒸餾水提取液（A）、乙醇提取液（B）、乙醚提取液（C）中的主要組分含量比較Fig.1 Comparison of contents of main component in water extract(A),ethanol extract (B) and ether extract (C) of 20 Chinese medicinal materials

由圖1可知，各種藥材提取液中成分含量有所不同，蒸餾水提取液中的總糖、還原糖、總酚、總皂苷和總黃酮含量相對較高。采用溶劑提取法進行藥材有效成分的提取，主要根據(jù)藥材中各有效成分的溶解性能不同而將其溶解出來。溶劑根據(jù)極性大小分為親水性和親脂性溶劑，水的極性大于乙醇和乙醚。中藥材化學成分也分為親水性和親脂性成分，如單糖、低聚糖和苷類為親水性成分[18]。

2.2 不同溶劑的20種中藥材提取液對米曲霉生長的影響

20種中藥材的不同提取液對米曲霉生長的菌落直徑、透明圈直徑（反映水解淀粉能力大小）、H/C值（反映米曲霉單位代謝合成淀粉酶的速率）的影響結果見圖2。

圖2 20種中藥材蒸餾水提取液（A）、乙醇提取液（B）和乙醚提取液（C）對米曲霉生長指標的影響Fig.2 Effects of water extract (A),ethanol extract (B) and ether extract (C) of 20 Chinese medicinal materials on growth indexes of Aspergillus oryzae

從圖2可以看出，中草藥的水提液對米曲霉的生長、水解淀粉能力的促進作用要強于乙醇提取液和乙醚提取液。

從圖2A可以看出，黃精、枸杞和杏仁的水提取液對米曲霉生長和水解淀粉能力促進作用最明顯，菌落直徑較空白組分別提高了75.86%、65.52%、57.47%，透明圈直徑較空白組分別提高了43.36%、31.60%、33.07%。黃精、枸杞和杏仁對米曲霉的H/C值呈現(xiàn)出抑制效果，其抑制率分別為15.56%、20.95%和18.56%；木香對米曲霉的抑制作用最明顯，菌落直徑較空白組降低了27.60%，菌落直徑較空白無明顯作用，但對米曲霉的H/C值促進作用最明顯，其H/C值較空白組提高了38.32%。

從圖2B可以看出，在乙醇提取液中，除菊花、蒼術、西洋參、當歸、石菖蒲、木香外，其他對米曲霉生長及水解淀粉的能力都有一定程度的促進作用。以枸杞、紅景天、地黃、黃精、杏仁對米曲霉生長的促進作用最明顯，菌落直徑較空白組分別提高了31.47%、24.56%、18.00%、16.45%、15.38%，透明圈直徑較空白組分別提高了5.70%、7.65%、6.98%、13.02%、4.93%，H/C值較空白組分別下降了19.76%、13.78%、9.58%、2.99%和8.98%。木香、石菖蒲和當歸對米曲霉生長的抑制作用效果最明顯，菌落直徑較空白組分別降低了52.17%、49.01%和37.09%，透明圈直徑較空白組分別降低了14.42%、10.66%和9.79%；木香、石菖蒲和當歸對米曲霉的H/C值的促進作用最明顯，H/C值較空白組分別提高了78.51%、74.80%、43.07%。

從圖2C可以看出，在乙醚提液中，黃精、枸杞和杏仁對米曲霉生長具有促進作用，菌落直徑較空白組分別提高了15.01%、2.63%和23.77%。具有抑制作用的有木香、石菖蒲、當歸、蒼術、菊花、辣蓼、人參、黃芪、麥冬和牛膝，菌落直徑較空白組降低了16.69%～63.51%。對米曲霉水解淀粉能力具有促進作用的有枸杞、何首烏、天門冬、川烏、牛膝、黃芪和杏仁，透明圈直徑較空白組提高了4.70%～28.64%。木香、石菖蒲和當歸對米曲霉的H/C值促進作用最明顯，H/C值較空白組分別提高了89.82%、85.03%和53.89%。

綜上，三種提取方式對于米曲霉的生長都有促進作用的中藥材有黃精、枸杞和杏仁，三種提取方式對米曲霉的生長都有抑制作用的中藥材是木香；石菖蒲、木香和當歸的醇提液和醚提液，能顯著提高單位米曲霉淀粉水解能力。此外，同一藥材的不同提取液對于同一菌種的作用效果也有不同，如菊花、蒼術、西洋參、當歸和石菖蒲用水提取時對于米曲霉的作用是促進，當用乙醇或乙醚提取時，對米曲霉的作用變?yōu)橐种啤?/p>

2.3 相關性分析

對藥材提取液中總糖、還原糖、總酚、總黃酮和皂苷與米曲霉生長的菌落直徑、透明圈直徑及H/C值進行相關分析，結果見表1。由表1可知，總糖與還原糖呈極顯著正相關性（P＜0.01），總糖、還原糖與菌落直徑及透明圈直徑呈顯著正相關性（P＜0.05），菌落直徑和透明圈直徑呈極顯著正相關性（P＜0.01），表明藥材中糖類成分通過促進微生物的生長，從而提高微生物水解淀粉的能力。皂苷類與H/C值呈極顯著正相關性（P＜0.01），皂苷類與菌落直徑及透明圈直徑呈極顯著負相關性（P＜0.01），表明藥材中所含皂苷類成分抑制米曲霉生長及淀粉降解能力。中草藥的成分組成比較復雜，除了多糖、黃酮、生物堿和皂苷等成分，還包含氨基酸、蛋白質、寡糖、微量元素、有機酸等，不同種類的藥材提取液中含有的有效成分不同，其主要起促進及抑制作用的成分也有差異。中藥材促菌、抑菌的物質基礎是其中所含的各種活性成分，常見的促菌成分主要是多糖，抑菌成分主要有黃酮類、酚類、生物堿和萜類[19-23]。研究顯示，皂苷類成分可通過與微生物膜甾醇形成復合物來破壞細胞膜的完整性，從而表現(xiàn)出抑菌活性[24，25]。本研究室前期采用逐步回歸分析探討了藥材成分種類對曲的糖化力酶活的影響，其結果顯示中藥材中的皂苷類成分可能有助于提高米曲糖化力[6]。本研究中，雖然皂苷對米曲霉生長和淀粉酶合成都呈現(xiàn)抑制作用，但是對于淀粉酶合成的抑制相對弱于對菌體生長的抑制作用，從而使單位米曲霉淀粉水解能力相對提高。由于皂苷組分在傳統(tǒng)制曲藥材中存在較多，且具有多方面的功效作用，其在傳統(tǒng)制曲釀造過程中的意義有待進一步探討。

表1 藥材提取液組分種類與米曲霉生長指標的相關分析Table 1 Correlation analysis between the components of extract and the growth index of Aspergillus oryzae

3 結論

以水作為溶劑提取出的總糖、還原糖、總酚、總黃酮和總皂苷含量最高，對米曲霉的生長和淀粉水解能力促進作用最明顯。

對米曲霉生長及淀粉水解能力促進作用最明顯的藥材為黃精、枸杞和杏仁，抑制作用最明顯的藥材為木香；對單位米曲霉淀粉水解能力（H/C值）促進作用最明顯的藥材為木香；

對20種中藥材提取液影響微生物生長試驗結果進行相關分析和析因分析，結果表明，皂苷類化合物對霉菌的生長具有抑制作用，但能提高單位霉菌淀粉水解能力。