邱 韻，劉逸寒，王曉丹*

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 天津市工業(yè)微生物重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

白酒風(fēng)味成分多達(dá)上百種，與白酒品質(zhì)優(yōu)劣密切相關(guān)[1-2]。醬香型白酒采用的高溫曲是以小麥為原料制成，小麥本身含有大量的酶和蛋白質(zhì)，在制曲過程中淀粉轉(zhuǎn)化為糖，蛋白質(zhì)分解成氨基酸，加上堆積發(fā)酵的高熱能條件下氨基酸和還原型單糖發(fā)生美拉德反應(yīng)而生成醬香物質(zhì)[3]。

白酒中1%～2%的微量成分是其風(fēng)味的主要來源。其中，甜味是一種能讓人愉悅的口感，特別是在高酒精度的白酒中，微甜味能使酒體更綿柔[4]。酵母菌在釀造過程中，生成酒精的同時能夠發(fā)酵糖產(chǎn)生多元醇，由于糖不能進(jìn)入白酒中[5-6]，因此多元醇是白酒中甜味物質(zhì)的主要來源，甜度隨羥基數(shù)增多而增強[7]。篩選產(chǎn)多元醇的酵母菌，并采用生物轉(zhuǎn)化來完成D-阿拉伯糖醇的生產(chǎn)成為現(xiàn)在比較熱門的研究方向[8-9]。本課題組前期從釀造醬香型白酒的大曲和酒醅中篩選出多株產(chǎn)多元醇類物質(zhì)比較高的酵母菌株，其中Debaryomyces coudertiiFBKL2.0130D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量最高，為（12.047±0.85）g/L[10]。在自然界中以天然狀態(tài)存在的D-阿拉伯糖醇僅在蘑菇和地衣中被發(fā)現(xiàn)[11-12]，因其含量太少，不能滿足人們的需求[13]。

本研究以Debaryomyces coudertiiFBKL2.0130為出發(fā)菌株，根據(jù)酵母中D-阿拉伯糖醇前體物D-核酮糖的代謝途徑（見圖1）[14-15]，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）從中擴(kuò)增出編碼D-阿拉伯糖醇脫氫酶的基因ARD，構(gòu)建重組質(zhì)粒Yep-PAK，并將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A中，得到重組菌株W303-ARD并成功表達(dá)，同時，對該重組酶的酶活及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定，研究該基因?qū)Χ嘣忌闪康挠绊?，為研究?gòu)建高產(chǎn)多元醇的酵母工程菌株奠定一定理論基礎(chǔ)。

圖1 D-核酮糖在酵母中的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways of D-ribulose in yeast

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

Debaryomyces coudertiiFBKL2.0130為貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院保藏的野生型菌株；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A及大腸桿菌（Escherichia coli）JM109均保藏于天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點實驗室；pUG-6質(zhì)粒：寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%。pH值自然，固體培養(yǎng)基中加2%瓊脂，115 ℃高壓滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉1%。pH值自然，固體培養(yǎng)基中加2%瓊脂，121 ℃高壓滅菌20 min。

模擬酒精發(fā)酵培養(yǎng)基[16]：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖14%。pH值自然，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

限制性內(nèi)切酶（10 U/μL）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶（5 U/μL）、Pyrobest高保真DNA聚合酶（5 U/μL）：日本TaKaRa公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、DNA膠回收試劑：美國OMEGA公司；一步法定向無縫克隆試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；遺傳霉素（G418）（100 mg/mL）、氨芐青霉素（100 mg/mL）：北京索萊寶科技有限公司；引物合成及基因組測序分析由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXDP-A2050恒溫培養(yǎng)箱：上海智城儀器廠；SS-325型全自動滅菌鍋：日本TOMY公司；TGL-16C臺式離心機：上海安亭科技儀器廠；Nexus SX1型PCR儀：德國Eppendorf公司；Gellogic212型全自動凝膠成像儀：美國SYNGENE公司；1645050型電泳儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

參考京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）公布的漢氏德巴利氏酵母（Debaryomyces hansenii）DEHA2A12144g中D-阿拉伯糖醇的代謝關(guān)鍵基因ARD基因序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計用于擴(kuò)增ARD1基因的引物對ARD1-F和ARD1-R，設(shè)計用于擴(kuò)增與載體Yep-PGK質(zhì)粒序列BglII酶切位點同源的引物ARD-U和ARD-D。根據(jù)pUG6質(zhì)粒序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計用于擴(kuò)增KanMX抗性基因序列的引物K-Yep-U和K-Yep-D。同時設(shè)計用于目的基因驗證的引用PGK-F、PGK-R、ARD-F、ARD-R，具體引物信息見表1。

表1 本研究所用PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 Sequences of PCR primers used in the study

1.3.2 ARD基因的PCR擴(kuò)增及驗證

采用石英砂研磨法[17]提取Debaryomyces coudertiiFBKL 2.0130的基因組，以其為模板，使用引物ARD1-F和ARD1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 2.0 μL；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）（2.5 mmol/L）1.5 μL；上游引物（10 μmol/L）1.0 μL；下游引物（10 μmol/L）1.0 μL；模板：1.0 μL；酶：0.5 μL；雙蒸水（ddH2O）補充至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用PCR終延伸加A尾，然后與T載體過夜連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。隨機挑取陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR驗證，并測序分析。

1.3.3 重組質(zhì)粒Yep-PAK的構(gòu)建

以Debaryomyces coudertiiFBKL2.0130的基因組為模板，使用引物ARD-U和ARD-D對目的基因ARD（897 bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。采用BglII單酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒Yep-PGK并純化回收?；厥债a(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒Yep-PA。以質(zhì)粒pUG6為模板，PCR擴(kuò)增得到兩端都含有SmaI酶切位點的KanMX抗性基因片段（1 613 bp），將質(zhì)粒Yep-PA及KanMX抗性基因用SmaI單酶切后并純化后進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒Yep-PAK。重組質(zhì)粒Yep-PAK構(gòu)建的具體流程見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒Yep-PAK的構(gòu)建流程Fig.2 Construction process of recombinant plasmid Yep-PAK

1.3.4 重組質(zhì)粒Yep-PAK的轉(zhuǎn)化和重組菌W303-ARD的驗證

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒Yep-PAK轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)中，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h后隨機挑選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增及BglII單酶切驗證。將重組質(zhì)粒Yep-PAK經(jīng)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[18]導(dǎo)入釀酒酵母W303-1A中，得到重組菌W303-ARD，涂布于含有900 mg/L G418的YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，隨機挑取正常生長的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及SmaI單酶切驗證。使用引物對PGK-F和ARD-R對重組菌W303-ARD進(jìn)行PCR驗證。

1.3.5 重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶的表達(dá)

取重組菌W303-ARD和親本菌W303-1A各一環(huán)分別接種于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。然后取1.0 mL種子液分別接種于50 mL的模擬酒精發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)6 d，參照文獻(xiàn)[19-21]測定D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力。

D-阿拉伯糖醇脫氫酶酶活力單位定義：在30 ℃、pH 9.6條件下每分鐘氧化1 μmol 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAD（P））或還原1 μmol 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD（P）H）所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 重組菌W303-ARD生長性能的測定

取重組菌株W303-ARD和親本菌株W303-1A各一環(huán)分別接種于YPD液體培養(yǎng)基，裝液量50 mL/250 mL，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 h后，每隔2 h取樣，采用紫外分光光度計在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。以培養(yǎng)時間（x）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（y）為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長曲線。

1.3.7 重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

最適作用溫度及熱穩(wěn)定性：以5 ℃為溫度梯度，在20～55 ℃范圍內(nèi)測定重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力，考察其最適作用溫度，將酶活最高值定為100%，計算在其他條件下的相對酶活力。以5 ℃為溫度梯度，將酶液分別置于不同溫度（20～55 ℃）條件下保溫2 h后測定酶活，考察其溫度穩(wěn)定性，將酶活力最高值定為100%，計算在其他條件下的相對酶活力。

最適作用pH值及pH穩(wěn)定性：在最適溫度條件下，分別以1.0為pH值梯度，在pH 5.0～11.0范圍內(nèi)測定重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力，考察其最適作用pH值，將酶活最高值定為100%，計算在其他條件下的相對酶活力。將酶液加入不同pH的緩沖液中在最適溫度保溫2 h后測定酶活。將最高的酶活力為100%，計算在其他條件下的相對酶活力。

金屬離子對重組酶D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力的影響：以不加金屬離子酶液為對照（CK），在反應(yīng)液中分別加入10 mmol/L CuSO4、MgCl2、KCl、BaCl2、CaCl2、MnCl2、FePO4、ZnCl2，測定重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力，考察金屬離子（Cu2+、Mg2+、K+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+）對其活性的影響。將原酶液活力定為100%，計算加入金屬離子溶液后的相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因ARD的獲得

以Debaryomyces coudertiiFBKL2.0130的基因組為模板，使用引物對ARD1-F和ARD1-R PCR擴(kuò)增得到D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因ARD，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因ARD PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Results of agarose gel electrophoresis of PCR product of D-arabinitol dehydrogenase gene ARD

由圖3可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長度在750～1 000 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相符，擴(kuò)增出的條帶單一，說明成功獲得目的基因ARD。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去測序，測序結(jié)果顯示，克隆得到的ARD基因由837個堿基組成，編碼278個氨基酸。將氨基酸序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）利用BLAST搜所對不同來源的D-阿拉伯糖醇脫氫酶氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果見圖4。

圖4 不同菌株D-阿拉伯糖醇脫氫酶氨基酸序列比對結(jié)果Fig.4 Alignment results of amino acid sequences of D-arabinitol dehydrogenase from different strains

由圖4可知，克隆得到的D-阿拉伯糖醇脫氫酶氨基酸序列與Debaryomyces hanseniiDEHA2A12144g的氨基酸序列相似性最高，為99%。

2.2 D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因的異源表達(dá)

2.2.1 目的基因片段的擴(kuò)增

以Debaryomyces coudertiiFBKL2.0130基因組為模板，使用引物ARD-U和ARD-D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到兩端各含15 bp與PGK序列BglII酶切位點同源序列的ARD基因片段，堿基長度為837 bp。

2.2.2 重組質(zhì)粒的驗證

圖5 重組質(zhì)粒Yep-PA（a）和Yep-PAK（b）的驗證結(jié)果Fig.5 Verification results of recombinant plasmid Yep-PA (a) and Yep-PAK (b)

由圖5a可知，以重組質(zhì)粒Yep-PA為模板，PCR擴(kuò)增ARD基因，可得到堿基大小為837bp的基因片段。通過測序，結(jié)果顯示質(zhì)粒Yep-PA構(gòu)建成功。由圖5b可知，對重組質(zhì)粒Yep-PAK進(jìn)行SmaI單酶切，可得到堿基大小為7 789 bp和1 613 bp的基因片段，電泳鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果均一致，證明重組質(zhì)粒Yep-PAK構(gòu)建成功。

2.2.3 重組菌W303-ARD的PCR驗證

以重組菌W303-ARD的質(zhì)粒為模板，用PGK-F和ARD-R引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，結(jié)果見圖6。

圖6 ARD基因異源表達(dá)重組菌株W303-ARD的PCR驗證Fig.6 PCR verification of mutant strain W303-ARD with gene ARD heteroexpression

由圖6可知，通過PCR擴(kuò)增可分別獲得堿基大小為2331bp的基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致，說明ARD基因異源表達(dá)重組菌株W303-ARD構(gòu)建成功。

2.3 重組菌W303-ARD生長性能的測定

圖7 重組菌株W303-ARD及親本菌株W303-1A的生長曲線Fig.7 Growth curves of recombinant strain W303-ARD and parent strain W303-1A

由圖7可知，重組菌株W303-ARD與親本菌株的生長趨勢基本一致，說明導(dǎo)入外源質(zhì)粒并且異源表達(dá)ARD基因的重組菌株的生長性能沒有受到影響。

2.4 重組菌W303-ARD D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力的測定

表2 D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力測定結(jié)果Table 2 Determination results of D-arabinitol dehydrogenase activity

由表2可知，D-阿拉伯糖醇脫氫酶的氧化還原活力均得到顯著提升，與親本菌株相比，重組菌株的D-阿拉伯糖醇脫氫酶的還原活力從（32.7±0.803）U/mL提高至（122.4±1.012）U/mL，氧化活力從（18.46±0.105）U/mL提高至（97.30±0.826）U/mL。

2.5 重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 最適作用溫度及熱穩(wěn)定性

由圖8（a）可知，在25～35 ℃之間D-阿拉伯糖醇脫氫酶的氧化、還原活力均在60%以上，且在30 ℃時，酶活力均達(dá)到最大，之后隨溫度的上升而下降。由圖8（b）可知，在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃恒溫2 h之后，其殘余的氧化、還原活力都保持在80%左右。而溫度上升至45 ℃之后，D-阿拉伯糖醇脫氫酶氧化、還原活力的穩(wěn)定性均呈迅速下降趨勢。由此可知，D-阿拉伯糖醇脫氫酶的最適作用溫度為30 ℃，在25～40 ℃范圍內(nèi)，D-阿拉伯糖醇脫氫酶氧化、還原活力的穩(wěn)定性較好。

圖8 重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶的最適溫度（a）及溫度穩(wěn)定性（b）Fig.8 Optimal temperature (a) and temperature stability (b) of recombinant D-arabinitol dehydrogenase

2.5.2 最適作用pH及pH穩(wěn)定性

圖9 重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶的最適pH值（a）及pH穩(wěn)定性（b）Fig.9 Optimal pH (a) and pH stability (b) of recombinant D-arabinitol dehydrogenase

由圖9（a）可知，重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶催化D-核酮糖還原的最適pH值為9.0，且在pH值9～11之間，能保持80%以上的相對活力；以D-阿拉伯糖醇為底物的最適pH值為7.0，該酶的氧化活性在pH值6.0～8.0之間能夠保持85%以上的相對活力。因此，重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶還原反應(yīng)的最適pH值為9.0，氧化反應(yīng)的最適pH值為7.0。由圖9（b）可知，恒溫2 h之后重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶在pH 9.0～11.0范圍內(nèi)殘余的還原活性都在80%以上，氧化活性在pH 7.0～8.0的范圍內(nèi)重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶的氧化活性能夠保持在一個較高水平。

2.5.3 金屬離子對D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力的影響

圖10 金屬離子對重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶活性的影響Fig.10 Effect of metal ions on recombinant D-arabinitol dehydrogenase activity

由圖10可知，重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶的氧化活性和還原活性均受到Cu2+、Ba2+、Zn2+的顯著抑制，其中Ba2+的抑制作用最明顯；Mg2+對重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶的氧化還原活性沒有明顯的影響；Ca2+、Mn2+、Fe3+均能提高重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力，其中Fe3+使D-阿拉伯糖醇脫氫酶相對氧化活力達(dá)到137%。

3 結(jié)論

本研究從Debaryomyces coudertiiFBKL2.0130中克隆D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因ARD，在釀酒酵母W303-1A中表達(dá)，構(gòu)建重組菌株W303-ARD。結(jié)果表明，與親本菌株相比，重組菌株的D-阿拉伯糖醇脫氫酶的還原活力從（32.7±0.803）U/mL提高至（122.4±1.012）U/mL，氧化活力從（18.46±0.105）U/mL提高至（97.30±0.826）U/mL。重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，在25～40 ℃范圍內(nèi)氧化、還原活力穩(wěn)定性均較好。還原反應(yīng)的最適pH值為9.0，在pH 9.0～11.0 范圍內(nèi)比較穩(wěn)定；氧化反應(yīng)的最適pH值為7.0在pH 7.0～8.0的范圍內(nèi)能夠保持較高水平。Cu2+、Ba2+、Zn2+均能抑制重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力；Mg2+對重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力沒有明顯的影響；Ca2+、Mn2+、Fe3+均能提高重組D-阿拉伯糖醇脫氫酶活力。