丁娟芳，楊 嘉 *，孫長花

（1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué) 生物與化工工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江蘇 揚(yáng)州 225000）

乳酸菌是一類可發(fā)酵糖類物質(zhì)，以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的細(xì)菌，通常被認(rèn)為是安全的益生菌[1-2]。在系統(tǒng)分類學(xué)上，乳酸菌分別隸屬于厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria），包含51個(gè)屬，至少包括741個(gè)種[3]。近幾年，乳酸菌對一些腐敗菌和食源致病菌的抑制作用引起了極大的關(guān)注。已報(bào)道的抑菌活性乳酸菌有發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、乳酸乳球菌（Lactococcal lactis）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）等[4-7]，部分乳酸菌的抑菌機(jī)制也陸續(xù)得到闡明[8-10]。

揚(yáng)州醬菜是江蘇揚(yáng)州地區(qū)的傳統(tǒng)食品，歷史悠久，風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者喜愛。稀甜醬是生產(chǎn)揚(yáng)州醬菜的主要原料之一，其釀制過程是醬菜生產(chǎn)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[11]，乳酸菌的發(fā)酵作用是其風(fēng)味形成的關(guān)鍵因素之一[12]。在稀甜醬的中溫發(fā)酵過程中，乳酸菌大量增殖，將部分糖分轉(zhuǎn)化成適量的有機(jī)酸，從而賦予了產(chǎn)品特有的風(fēng)味。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中含有豐富的微生物資源，而揚(yáng)州稀甜醬中乳酸菌的多樣性及活性的研究尚無報(bào)道。本研究旨在從揚(yáng)州稀甜醬中分離、純化乳酸菌，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定，闡述其多樣性，并對發(fā)酵濾液的抑菌活性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供良好的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

稀甜醬：揚(yáng)州三和四美醬菜有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 試劑

KOD FX脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（1.0 U/μL）：日本TOYOBO公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒：德國Qiagen公司；DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen公司；瓷珠菌種保存管：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶（2 000～5 000 U/mg）：美國Sigma-Aldrich公司；碳酸鈣、氫氧化鈉、甘油、雙氧水（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 指示菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 6538）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）（ATCC 19115）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）（ATCC 25922）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）（ATCC 6633）：廣東省食品微生物安全工程研究開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SQ510C滅菌鍋：日本YAMATO公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Bugbox M厭氧工作站：英國Ruskinn公司；AL104電子分析天平、FE22 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ECLIPSE生物顯微鏡：日本尼康公司；3-30k冷凍臺式高速離心機(jī)：德國Sigma公司；U-3010紫外分光光度計(jì)：日本Hitachi公司；9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：美國ABI公司；DYY-8C電泳儀、WD-9413B凝膠成像分析儀：北京六一生物科技有限公司；FC-08拍打式均質(zhì)器：杭州賽普科學(xué)儀器有限公司；Micro Stainer全自動革蘭氏染色儀：上海皓信生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

稱取10 g稀甜醬樣品于無菌均質(zhì)袋中，加入90 mL無菌生理鹽水，拍擊均質(zhì)1 min，制成10-1樣品均液。吸取1 mL10-1樣品均液于9 mL無菌生理鹽水中，振蕩均勻，得到10-2樣品均液。重復(fù)以上操作制成逐級稀釋后的樣品均液。吸取稀釋度為10-5的樣品均液1 mL于無菌平皿內(nèi)，將冷卻至適宜溫度的含有0.2 g/L碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基傾注平皿，混合均勻后置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的單菌落，純化后進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)，革蘭氏陽性且接觸酶陰性[13-14]的菌株列為疑似乳酸菌，由瓷珠吸附后置于含50%甘油的MRS肉湯培養(yǎng)基中，-70 ℃超低溫環(huán)境中進(jìn)行保存。

1.3.2 菌種鑒定

（1）形態(tài)觀察和生理生化鑒定

將疑似乳酸菌活化2代后接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h后觀察其菌落形態(tài)。參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[13]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]對乳酸菌進(jìn)行生理生化鑒定，碳源利用試驗(yàn)采用生化鑒定管進(jìn)行。

（2）分子生物學(xué)鑒定

按照文獻(xiàn)[15]方法提取菌株的基因組，以通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）、1492r（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）對分離菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序。引物合成及測序結(jié)果均委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對搜索，選擇序列同源性較高的菌株的16S rRNA序列，用Clustal X進(jìn)行多重比對，采用MEGA 7.0.26軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析分離菌株與已知菌株的同源性。

1.3.3 發(fā)酵濾液抑菌試驗(yàn)

按照文獻(xiàn)[15]的方法準(zhǔn)備乳酸菌菌液，使菌液OD600nm值在0.6～0.8范圍內(nèi)。將菌液以10%（V/V）的接種量添加到50 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm無菌濾膜過濾后于4 ℃條件下保存。

濾液的抑菌活性試驗(yàn)采用牛津杯平板擴(kuò)散法[16]進(jìn)行，指示菌分別為金黃色葡萄球菌（S.aureus）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）、大腸埃希氏菌（E.coli）和枯草芽胞桿菌（B.subtilis），每項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)置3組平行和1組空白對照（MRS肉湯培養(yǎng)基）。用2代指示菌的新鮮腦心浸液肉湯培養(yǎng)液傾注營養(yǎng)瓊脂平板制備試驗(yàn)平板，試驗(yàn)平板中菌體濃度控制在1×105～1×106CFU/mL。將濾液和空白對照用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 7.0，以中和有機(jī)酸的干擾，再加入終質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的過氧化氫酶，于37 ℃水浴2 h，以排除過氧化氫的干擾[17]。在牛津杯（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm）內(nèi)加入0.2 mL處理后的濾液和空白對照，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其是否有抑菌圈。用十字測量法測定其抑菌圈直徑，直徑＞10 mm時(shí)判定為有抑菌作用[18]，空白對照應(yīng)無抑菌圈產(chǎn)生，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

從稀甜醬樣品中共分離得到64株有明顯溶鈣圈的菌株，其中33株革蘭氏染色陽性且接觸酶試驗(yàn)陰性，初步確定為乳酸菌[13-14]，將其編號為TJ01～TJ33。篩選到的菌株在MRS固體培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)為圓形、中央凸起、表面光滑濕潤、邊緣整齊的乳白色菌落。在顯微鏡油鏡下，菌株TJ10和TJ25細(xì)胞呈現(xiàn)為單個(gè)或呈鏈狀排列的無芽孢革蘭氏陽性桿菌，其他菌株細(xì)胞均為單個(gè)、成對、四聯(lián)、成鏈或成片出現(xiàn)的革蘭氏陽性球菌。部分代表菌株的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果見圖1。

圖1 12株代表菌株的革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Gram staining results of 12 representative strains

2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

將33株乳酸菌接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，于36 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。乳酸菌在厭氧培養(yǎng)條件下均能正常生長，說明分離得到的菌株均為兼性厭氧菌。部分代表菌株的生理生化特征和碳源利用試驗(yàn)結(jié)果分別見表1和表2。

表1 12株代表菌株的生理生化特征Table 1 Biochemical and physiological characteristics of 12 representative strains

表2 12株代表菌株的碳源利用試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of carbon sources utilization tests of 12 representative strains

續(xù)表

由表1及表2可知，菌株TJ10和TJ25均為接觸酶陰性、不產(chǎn)生H2S、pH 4.5條件下能夠生長的兼性厭氧桿菌，初步鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus）。菌株TJ07和TJ26代謝葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、15 ℃生長、45 ℃不生長，初步鑒定為魏斯氏菌屬（Weissella）。菌株TJ05、TJ08、TJ15和TJ23代謝葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在15 ℃、45 ℃、6.5%NaCl和pH 9.6條件下均可以生長，初步鑒定為腸球菌屬（Enterococcus）；菌株TJ04、TJ12、TJ17和TJ31代謝葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在18%NaCl中不能生長，初步鑒定為片球菌屬（Pediococcus）。碳源利用試驗(yàn)結(jié)果和生理生化鑒定結(jié)果有一定的匹配性，大多初步鑒定為同屬的代表菌株表現(xiàn)出相同或相似的碳源利用能力。結(jié)合生理生化特征和碳源利用試驗(yàn)情況，其他21株菌株的初步鑒定結(jié)果見表3。

表3 基于生理生化試驗(yàn)21株菌株的初步鑒定結(jié)果Table 3 Preliminary identification results of 21 strains based on biochemical and physiological tests

2.3 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

將分離得到的33株乳酸菌的16S rRNA序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast相似性分析，選擇同源性較高的菌株的16S rRNA序列，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于16S rRNA序列33株乳酸菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 33 strains of lactic acid bacteria based on 16S rRNA sequences

由圖2可知，菌株TJ01、TJ02等15株菌株與屎腸球菌（Enterococcus faecium）聚于同一分支，相似度均為99%，可鑒定為屎腸球菌；菌株TJ04、TJ06等12株菌株與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）聚于同一分支，相似度均為99%，可鑒定為乳酸片球菌；菌株TJ07、TJ09等4株菌株與類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）聚于同一分支，相似度均為99%，可鑒定為類腸膜魏斯氏菌；菌株TJ10和TJ25與酸魚乳桿菌（Lactobacillus acidipiscis）處于同一分支，相似度均為100%，鑒定為酸魚乳桿菌。由此得出，稀甜醬中分離得到的屎腸球菌和乳酸片球菌數(shù)量最多，分別占總分離乳酸菌數(shù)的45.5%和36.4%，為優(yōu)勢乳酸菌。

2.4 乳酸菌發(fā)酵濾液的抑菌活性

乳酸菌的發(fā)酵濾液中往往含有較多的乙酸、乳酸、過氧化氫等有抑菌效果的代謝產(chǎn)物[19-20]，本試驗(yàn)通過調(diào)節(jié)pH和加入過氧化氫酶排除以上干擾因素[17]，測定33株乳酸菌發(fā)酵液的抑菌活性，結(jié)果顯示，空白對照未產(chǎn)生抑菌圈，33株乳酸菌僅有菌株TJ17和TJ31具有抑菌活性，其抑菌圈直徑見表4。

表4 乳酸菌TJ31和TJ17發(fā)酵濾液對指示菌的抑制作用Table 4 Antibacterial activity of fermented filtrate of lactic acid bacteria strains TJ31 and TJ17

由表4可知，乳酸菌TJ17和TJ31發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌以及大腸埃希氏菌均有一定的抑制作用，且乳酸菌TJ31的抑菌效果強(qiáng)于菌株TJ17，但都對枯草芽孢桿菌無抑制作用。

菌株TJ17和TJ31經(jīng)鑒定為乳酸片球菌。近年來，乳酸片球菌的益生活性[21]引起廣泛關(guān)注，而抑菌能力是乳酸片球菌的重點(diǎn)研究內(nèi)容之一。有研究表明，來源于片球菌屬的細(xì)菌素（bacteriocins）類物質(zhì)對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌有著強(qiáng)烈的抑制作用[22]，本實(shí)驗(yàn)中的乳酸片球菌發(fā)酵產(chǎn)物對上述兩種致病菌的抑制作用也較為明顯，因此，值得對其有效抑菌成分開展進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

利用經(jīng)典乳酸菌篩選法從揚(yáng)州稀甜醬中共分離得到33株乳酸菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA序列分析，鑒定15株為屎腸球菌（E.faecium）、12株為乳酸片球菌（P.acidilactici）、4株為類腸膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides）、2株為酸魚乳桿菌（L.acidipiscis），其中屎腸球菌和乳酸片球菌分別占總分離乳酸菌數(shù)的45.5%和36.4%，為稀甜醬中的優(yōu)勢乳酸菌。乳酸片球菌TJ17和TJ31發(fā)酵濾液對金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和大腸埃希氏菌均有明顯的抑制作用，且乳酸片球菌TJ31抑菌效果較好。