衛(wèi)春會(huì)，車路萍，汪文鵬，鄧 杰，任志強(qiáng)，黃治國*

（1.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.重慶江記酒莊有限公司，重慶 402260）

濃香型白酒窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協(xié)調(diào)、尾凈余長，是最受消費(fèi)者喜愛的白酒之一。濃香型白酒以高粱、大米、玉米等淀粉質(zhì)谷糧為原料，以中溫大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)長時(shí)間的泥窖密封發(fā)酵后蒸餾而得，其中泥窖密封發(fā)酵是形成濃香型白酒風(fēng)味的過程，也是多種微生物繁衍更替的過程[1-2]。窖泥是濃香型白酒制勝的法寶，也是生產(chǎn)必不可少的基礎(chǔ)，其內(nèi)含有大量的生香功能菌，這些功能菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)在酯化酶作用下合成的酯類物質(zhì)是濃香型白酒窖香濃郁的根本[3-4]。因此，加強(qiáng)窖泥中的酯化菌的研究對提升窖內(nèi)酒醅質(zhì)量具有重要意義。

目前為止，對窖泥中厭氧微生物的研究已超過幾百種，其中生香功能細(xì)菌主要包括己酸菌、芽孢桿菌、乳酸菌、羧酸菌等[5-7]。王春艷等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌（Clostridium）對濃香型白酒的濃郁窖香具有重要貢獻(xiàn)，其代謝產(chǎn)物主要為己酸和丁酸，同時(shí)伴隨一些氫的產(chǎn)生。當(dāng)甲烷菌與同產(chǎn)己酸的梭菌共生時(shí)能有效促進(jìn)己酸乙酯生成，該研究對復(fù)合功能菌液和人工窖泥的改造培養(yǎng)提供了重要理論指導(dǎo)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，窖池中的酯化菌以芽孢菌為主，岳元媛等[2]對瀘州老窖不同窖齡的窖泥中產(chǎn)香的兼性厭氧菌進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）為窖池優(yōu)勢菌屬，其中大多菌株能產(chǎn)生丁酸和己酸等有機(jī)酸；侯小歌等[10]研究發(fā)現(xiàn)白酒在發(fā)酵中、后期，酒醅中的芽孢桿菌大量增殖，成為優(yōu)勢菌群，是重要的酯化生香菌。

針對窖泥酯化生香菌微生物多為厭氧芽孢桿菌[11]，本試驗(yàn)以優(yōu)質(zhì)老窖泥為研究對象，厭氧條件下富集酯化菌，并對富集條件進(jìn)行優(yōu)化，通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatographicmass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)對富集液中的酯類物質(zhì)及其含量進(jìn)行檢測，確定富集效果；再通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法從中篩選產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的菌株，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行菌種鑒定，并研究其生長特性，以期為提高濃香型白酒酒質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

窖泥：無菌操作采集瀘州某名優(yōu)酒廠老窖池底泥，迅速置于冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：乙酸鈉3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉粉10.0g/L、L-半胱氨酸鹽0.25g/L、酵母粉3.0g/L、葡萄糖5.0 g/L、可溶性淀粉1.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、超純水1 000 mL、pH值為6.0±0.1，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、氯化鈉0.01 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.25 g/L、硫酸錳0.01 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）0.5 g/L、蛋白胨0.1 g/L、酵母膏1.0 g/L、瓊脂20 g/L、三丁酸甘油酯4 mL（在倒平板前加入）、超純水1 000 mL，自然pH值，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

1.1.3 試劑

乙酸鈉、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鎂、瓊脂、三丁酸甘油酯（均為分析純）、乙酸正丁酯（色譜純）：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；EMS、L-半胱氨酸鹽酸鹽（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE壓力蒸汽滅菌鍋：日本Hirayama公司；BF-2000M氮?dú)獯禎饪s儀：北京八方世紀(jì)科技有限公司；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱、HW326恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；M367983聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國伯樂公司；YIQI-125凝膠成像系統(tǒng)：德國VILBER公司；7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司；α1860紫外分光光度計(jì)：上海普元儀器有限公司；AW200SG厭氧工作站：金壇市科技分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥中酯化菌的富集方法

稱取5 g窖泥裝入含有45 mL無菌水的螺口瓶中，90 ℃恒溫水浴處理30 min，冷卻后于厭氧工作站按5%（V/V）的接種量接入富集培養(yǎng)基中，34 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3.2 窖泥中酯化菌富集條件的確定

富集時(shí)間：樣品同1.3.1處理后，分別于34 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d、28 d，每組試驗(yàn)3組平行。

富集次數(shù)：樣品同1.3.1處理后，在最佳富集時(shí)間下對富集液連續(xù)富集4次。

通過HS-SPME-GC-MS檢測富集液中酯類物質(zhì)含量及種類確定最佳富集時(shí)間和次數(shù)。

1.3.3 窖泥中酯化菌的分離純化

將富集液于90 ℃恒溫水浴處理30 min后，吸取1 mL富集液，按10倍梯度稀釋至10-5，選取稀釋梯度為10-2～10-5的菌液0.1 mL分別涂布至篩選培養(yǎng)基（已在厭氧工作站中靜置24 h），34 ℃條件下培養(yǎng)2～10 d（期間觀測菌落變化），挑選有透明圈的菌落進(jìn)行分離、純化。將純化后的單菌株接種于富集培養(yǎng)基中（加入2%（V/V）乙醇），34 ℃培養(yǎng)15 d，通過GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物中有無己酸乙酯或丁酸乙酯。

1.3.4 窖泥中酯化菌培養(yǎng)條件研究

種子液制備：于厭氧工作站中將目的菌株分別接種于液體篩選培養(yǎng)基中，34 ℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)48 h。

生長曲線：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于液體篩選培養(yǎng)基，34 ℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)，每8 h取出8 mL培養(yǎng)液，采用紫外分光光度計(jì)在波長660 nm處測定吸光度值（OD660nm值）。

生長溫度：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于液體篩選培養(yǎng)基，分別置于20 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃和60 ℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)48 h。

生長pH值：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于不同pH值（2～10）的液體篩選培養(yǎng)基，34 ℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)48 h。

乙醇耐受性：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)不同（2%～23%）的液體篩選培養(yǎng)基，34 ℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)48 h。

以上試驗(yàn)分別取8 mL發(fā)酵液，測定OD660nm值，且均以未接種的培養(yǎng)基為空白對照。

1.3.5 窖泥中酯化菌的鑒定

形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)：根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[12]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]對篩選的目的菌株選擇性地進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定[14-15]。

分子生物學(xué)鑒定：提取目的菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用細(xì)菌通用引物27F、1492r對目的菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16-17]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交至美國國家生物信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0軟件的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 酯類物質(zhì)的檢測

取5 mL富集液或發(fā)酵液于頂空瓶中，再加入2 g NaCl和0.25 mL乙酸正丁酯（0.2 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)，混勻，置于55 ℃固相微萃取儀中平衡15 min后，插入萃取針頭萃取30 min，參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行GC-MS檢測。質(zhì)譜圖通過與美國Agilent公司提供的美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）05a.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行比對，利用匹配度均＞800的特征離子進(jìn)行定性分析；采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。利用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥中酯化菌富集方法的優(yōu)化

窖泥經(jīng)不同富集時(shí)間、不同富集次數(shù)富集后，采用HSSPME-GC-MS檢測富集液中酯類物質(zhì)含量和種類數(shù)的變化，結(jié)果見圖1。

圖1 富集時(shí)間（a）及富集次數(shù)（b）對富集液中酯類化合物含量和種類數(shù)的影響Fig.1 Effect of enrichment time (a) and number of enrichment (b) on the content and type of ester compounds in esterified liquid

由圖1a可知，隨著富集時(shí)間的延長，窖泥富集液中酯類物質(zhì)種類數(shù)和含量均呈先增加后穩(wěn)定的變化趨勢。富集16 d時(shí)，窖泥富集液中酯類物質(zhì)種類數(shù)達(dá)到11種，酯類物質(zhì)總含量達(dá)到199 mg/100 mL，均顯著高于富集前期（P＜0.05）。富集16 d后，隨著富集時(shí)間的延長，窖泥富集液中酯類物質(zhì)種類數(shù)和含量均趨于穩(wěn)定，變化不顯著（P＞0.05）。這可能是由于富集16 d后目標(biāo)菌群進(jìn)入穩(wěn)定期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗及富集液中微生物代謝產(chǎn)物的積累，目標(biāo)菌群生長受到抑制逐漸進(jìn)入衰亡期。

由圖1b可知，隨著富集次數(shù)的增加，窖泥富集液中酯類物質(zhì)含量呈先上升后降低的變化趨勢，富集2次時(shí)，酯類化合物含量達(dá)到最大（280 mg/100 mL），顯著高于1次富集（P＜0.05）；而酯類物質(zhì)種類數(shù)隨富集次數(shù)增加呈下降變化，富集2次時(shí)酯類物質(zhì)種類數(shù)為8種，隨后趨于穩(wěn)定，變化不顯著（P＞0.05）。這可能是由于第一次富集液中產(chǎn)酯微生物種類豐富但生物量較少，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物酯類物質(zhì)種類數(shù)多而含量較少，隨著富集次數(shù)增加，富集液中微生物逐漸被馴化，部分微生物被淘汰，優(yōu)勢產(chǎn)酯微生物愈加的集中，使得富集液中的酯類物質(zhì)種類數(shù)趨于穩(wěn)定而含量升高[19]。因此，窖泥富集液富集培養(yǎng)16 d，富集2次有利于酯化菌的富集。但為保證目標(biāo)微生物的富集效果，略微延長富集時(shí)間，選擇富集時(shí)間為20 d。

2.2 窖泥中酯化菌的分離與篩選

采用稀釋平板涂布法從優(yōu)化后的窖泥富集液中分離出23株菌，再通過HS-SPME-GC-MS檢測復(fù)篩出3株代謝生產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3。

2.3 酯化菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

3株菌株的菌落、細(xì)胞形態(tài)及其革蘭氏染色結(jié)果見圖2。

圖2 3株菌株的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of 3 strains

由圖2可知，3株菌皆為厭氧的革蘭氏陽性（G+）白色桿狀細(xì)菌。菌株Y1的菌落呈米白色、正反面顏色一致、邊緣規(guī)整、圓形、外觀形態(tài)小，細(xì)胞呈桿狀、有一定的排列方式，革蘭氏陽性，厭氧；菌株Y2的菌落呈灰白色、菌落中間顏色較淺、邊緣顏色較白、較光滑、比較濕潤、不易于挑取，細(xì)胞呈桿狀，G+，厭氧；菌株Y3的菌落呈黃白色、濕潤、光滑、不透明、外觀形態(tài)小、易于挑取，細(xì)胞呈桿狀，G+，厭氧。

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果

3株菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 3株菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical identification of 3 strains

由表1可知，菌株Y2水解淀粉結(jié)果為陰性，菌株Y3的接觸酶試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，除此之外，3株菌株的其他生理生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果均呈陽性。結(jié)合形態(tài)觀察，初步鑒定菌株Y1、Y2、Y3均為厭氧梭菌屬（Clostridiumsp.）。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株Y1～Y3純化后提取基因組DNA，以其為模板進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增，采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 3株菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Results of agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR product of 3 strains

由圖3可知，3株菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度為1 600 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，委托上海美吉公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 基于16S rDNA基因序列3株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 3 strains based on 16S rDNA gene sequences

由圖4可知，菌株Y1與拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株Y2與Clostridium guangxiense聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株Y3與Clostridium sartagoforme聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定菌株Y1、Y2、Y3分別為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、Clostridium guangxiense、Clostridium sartagoforme。有文獻(xiàn)報(bào)道，C.beijerinckii、C.guangxiense能發(fā)酵產(chǎn)丁醇，特別是C.beijerinckii能夠利用糖質(zhì)和木質(zhì)素水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇，在用生物法來生產(chǎn)丁醇中得到廣泛應(yīng)用[20-21]；C.sartagoforme是一種纖維素（和幾丁質(zhì)）降解細(xì)菌[22]。

3株酯化菌均為厭氧梭菌，這可能是由于梭菌在優(yōu)質(zhì)窖泥中已經(jīng)是優(yōu)勢微生物[23-26]，經(jīng)過富集培養(yǎng)基多輪次富集，在富集液中占據(jù)主導(dǎo)地位，這也表明窖泥中的梭菌可能為濃香型白酒釀造中重要的酯化生香菌。因此，加強(qiáng)這3株菌的研究對提升白酒質(zhì)量具有重要意義。

2.4 酯化菌培養(yǎng)條件試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 3株菌株的生長曲線

為了解菌株Y1、Y2、Y3的生長情況，在厭氧條件下測定3株菌株的生長曲線，結(jié)果見圖5。

圖5 3株菌株厭氧條件下的生長曲線Fig.5 Growth curve of 3 strains in the anaerobic condition

由圖5可知，3株菌株的生長趨勢一致，生物量均呈先上升后穩(wěn)定再下降的變化趨勢，其中前24 h為延滯期；24～64 h為對數(shù)生長期；64～80 h為平穩(wěn)期；80 h后進(jìn)入衰亡期。這可能是由于前24 h菌株正在適應(yīng)新的培養(yǎng)液環(huán)境，大量合成細(xì)胞分裂所需的酶類及其他細(xì)胞成分，細(xì)胞生長但不分裂，培養(yǎng)液中生物量不變；24 h后菌株已適應(yīng)新的生長環(huán)境，豐富的營養(yǎng)物質(zhì)使它們快速生長繁殖；64 h后培養(yǎng)液中的大部分營養(yǎng)物質(zhì)被消耗以及代謝產(chǎn)物的累積，使得部分微生物消亡，此時(shí)微生物的增長和消亡趨于穩(wěn)定，3株菌株生物量保持穩(wěn)定；80 h后培養(yǎng)液中可利用營養(yǎng)物質(zhì)完全被利用，微生物逐漸消亡。

2.4.2 3株菌株最適生長溫度、pH及耐乙醇能力試驗(yàn)

通過紫外分光光度計(jì)檢測菌株Y1～Y3經(jīng)不同溫度、不同pH值及不同體積分?jǐn)?shù)乙醇培養(yǎng)后的OD660nm值，結(jié)果見圖6。

圖6 溫度（a）及pH值（b）對3株菌株生長的影響及其耐乙醇能力（c）Fig.6 Effect of temperature (a) and pH (b) on 3 strains growth and its ethanol tolerance (c)

由圖6可知，隨著培養(yǎng)溫度、pH值的升高，3株菌株的生物量均呈先增加后降低的趨勢，且3株菌株均在溫度為30～41 ℃、pH值為5～10、乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%～8%的范圍內(nèi)生長良好。其中，菌株Y1的最佳生長溫度為30 ℃、最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為23%；菌株Y2的最佳生長溫度為34 ℃、最適生長pH值為7、耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%；菌株Y3的最佳生長溫度為37 ℃，最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%。

3株菌株均能在窖池環(huán)境中良好生長，這與篩選環(huán)境有關(guān)。菌株Y1～Y3來自濃香型窖池底部的優(yōu)級窖泥，長期處于釀酒環(huán)境使得3株菌不斷被馴化，具有較高的耐乙醇能力[27]。此外，這3株菌的最佳生長溫度在30～37 ℃，這可能表明它們主要生長在濃香型白酒的發(fā)酵的高溫期，窖池內(nèi)糟醅發(fā)酵溫度分為“前緩、中挺、后緩落”三個(gè)階段，其中中挺階段發(fā)酵溫度一般在30 ℃以上[28]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對窖泥酯化菌的富集方法進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)富集液培養(yǎng)20 d、連續(xù)富集2次，富集液中酯化菌的富集效果最好。采用傳統(tǒng)分離方法從優(yōu)化富集液中分離、篩選得到3株產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯較強(qiáng)的酯化菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株Y1為Clostridium beijerinckii、Y2為Clostridium guangxiense、Y3為Clostridium sartagoforme。通過對3株菌株的生長特性研究發(fā)現(xiàn)，菌株Y1的最佳生長溫度為30 ℃、最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為23%；菌株Y2的最佳生長溫度為34 ℃、最適生長pH值為7、耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%；菌株Y3的最佳生長溫度為37 ℃，最適生長pH值為5、耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%。3株菌株均能在濃香型白酒窖內(nèi)進(jìn)行很好的生長繁殖，加強(qiáng)這3株菌株的研究對提升濃香型白酒糟醅質(zhì)量具有重要作用。