馬英輝，李利軍*，盧美歡，仝澤方

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

硒（selenium）是人體必需的微量元素，參與了人體的抗氧化和免疫等多個生物學(xué)代謝過程，對人體健康具有非常重要的意義，缺硒會引起或誘發(fā)克山病、骨骼肌壞死、心腦血管等多種疾病[1-2]。人體硒元素主要來源于日常食物，食物中的硒主要來源于土壤，而我國大部分地區(qū)土壤都嚴重缺硒[3-4]，從而造成了我國食物中缺硒狀況。另外，我國天然富硒地區(qū)土壤中硒的存在形式主要以硒銻礦為主，硒酸鹽為輔，硒礦中的硒形態(tài)無法被植物直接吸收利用，硒鹽由硒礦經(jīng)過長期淋溶和風(fēng)化等作用產(chǎn)生，具有劇毒性且分布極不均勻[5]。以往對轉(zhuǎn)化硒微生物的研究主要集中在利用富硒微生物發(fā)酵富硒食品領(lǐng)域，且以有機硒為主[6-7]，而近年來微生物納米硒（selenium nanoparticles，SeNPs）因具有制備簡單、毒性低、活性高等優(yōu)點成為研究熱點。

1 納米硒簡介

納米硒是指通過化學(xué)法或微生物法將硒酸鹽或亞硒酸鹽還原為納米形態(tài)的硒單質(zhì)?；瘜W(xué)法還原生成的納米硒單質(zhì)（圖1a）穩(wěn)定性較差，粒徑不均一，生物活性較低；而通過微生物法轉(zhuǎn)化的納米硒（圖1b）穩(wěn)定性較好，顆粒大小較均一，并能夠通過微生物在納米硒表面的包裹修飾，使得所制備的納米硒性質(zhì)更穩(wěn)定，生物活性更高[8-9]。許定[10]利用透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，微生物納米硒表面包裹一層有機物（圖1c），通過傅里葉紅外光譜（圖2）發(fā)現(xiàn)，微生物納米硒與化學(xué)納米硒的基團峰明顯不同，而與細胞破碎液的基團峰相似，說明微生物納米硒中存在與細胞破碎液相似的有機物，并通過電泳手段對有機物進行定量分析，確定了微生物轉(zhuǎn)化生成的納米硒表面有機物為蛋白質(zhì)、糖類及少量的脂類，且對納米硒的穩(wěn)定性起著重要的作用。

圖1 微生物納米硒與化學(xué)納米硒形態(tài)比較Fig.1 Comparison of morphology of microbial nano-selenium and chemical nano-selenium

隨后，科研人員利用其他檢測手段對微生物納米硒進行了表征。WANG Y T等[11]利用能量色散X射線分析（energy dispersive X-ray，EDX）和動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）對轉(zhuǎn)化的納米硒進行表征，發(fā)現(xiàn)納米硒平均直徑為（273.8±16.9）nm，產(chǎn)生了1.37 keV、11.22 keV和12.49 keV三個特定的硒吸收峰值；劉紅芳等[9，12]利用光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）對微生物產(chǎn)生的納米硒進行分析發(fā)現(xiàn)，納米硒顆粒表面存在零價硒（Se0）和負二價硒（Se2-）兩種形態(tài)，這也說明了微生物納米硒顆粒表面存在含硒蛋白或多糖的可能性。

圖2 微生物納米硒、化學(xué)納米硒和細胞破碎液的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectroscopy of microbial nanoselenium,chemical nano-selenium and cell breaking fluid

微生物納米硒的活性和安全性也是近幾年研究的重點[13]，根據(jù)急性毒性數(shù)據(jù)顯示，無機硒的半數(shù)致死量（half lethal dose，LD50）為15 mg/kg，有機硒的LD50為30～40 mg/kg，微生物納米硒的LD50為113 mg/kg，由此可見，微生物納米硒的急性毒性是所有硒源中最低的[14]。而在慢性毒性方面，通過給小鼠飼喂不同形態(tài)的硒發(fā)現(xiàn)，微生物納米硒的毒性也是最低的[15]，現(xiàn)在市場上也出現(xiàn)了與納米硒相關(guān)的具有保健功能的產(chǎn)品，如“硒旺膠囊”，其主要功效成分為納米硒。

2 可轉(zhuǎn)化納米硒的微生物種類

納米硒和其他納米材料一樣，最初是通過各種化學(xué)方法合成的，然而，該方法成本較高、副產(chǎn)品有毒，從而推動了納米硒轉(zhuǎn)化新方法的研究[16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，有些微生物可以轉(zhuǎn)化有毒的金屬離子為毒性較小的形態(tài)，包括金屬沉淀劑或納米級單質(zhì)?；谶@一特點，研究人員把重點放在利用微生物方法轉(zhuǎn)化納米硒上[17-18]。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種能夠用于納米硒轉(zhuǎn)化的細菌，主要包括變形菌門中的大腸桿菌（Escherichia coli）[19]、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）[20]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[21]、克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）[22]、伯克霍爾德菌（Burkholderiasp.）[23]等；厚壁菌門中的乳桿菌（Lactobacillus）[24]、葡萄球菌（Staphylococcus）[25]、芽孢桿菌（Bacillussp.）[18]等；放線菌門中的鏈霉菌（Streptomycesp.）[26]和雙歧桿菌（Bifidobacterium）[27]等以及藍藻門的節(jié)旋藻（Artrospira）[28]。

合成納米硒真菌的研究主要集中于酵母，JIMENEZLAMANA J等[29]研究了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在富硒培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化納米硒的特征及影響條件，獲得了良好的納米硒轉(zhuǎn)化效果；HARILAKRISHNAN H等[30]也利用酵母轉(zhuǎn)化獲得了直徑為30～100 nm的納米硒顆粒[30]。除酵母外，轉(zhuǎn)化納米硒的真菌還有擔(dān)子菌、子囊真菌和曲霉菌等。如平菇（Pleurotus ostreatus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和綠色木霉（Trichoderma viride）在含有硒的平板培養(yǎng)基上生長時，會在真菌菌絲上轉(zhuǎn)化生成可見的單質(zhì)硒[31]。

3 微生物轉(zhuǎn)化納米硒機制研究

目前，雖然已發(fā)現(xiàn)了許多以硒酸鹽為原料，能夠轉(zhuǎn)化生成納米硒的微生物，但由于各種微生物代謝的差異，對硒的轉(zhuǎn)化也存在不同的路徑和條件，但總體是通過還原性生物酶的作用將硒酸鹽或亞硒酸鹽逐步還原生成零價納米硒的過程。微生物還原硒酸鹽生成納米硒的機制見圖3[32-34]。無氧條件下，革蘭氏陰性菌可以通過硒酸根離子作為電子受體進行呼吸作用，首先，硒酸根離子進入細胞周質(zhì)空間，在硒酸鹽還原酶ABC（selenate reductase ABC，SerABC）的作用下生成亞硒酸根離子，然后進入細胞膜內(nèi)，在亞硒酸鹽非特異性還原酶的作用下將亞硒酸根還原成納米硒顆粒，最后通過外泌排到體外[32-33]。而在有氧的條件下，有些菌株對硒酸鹽的還原是通過硫酸鹽代謝途徑進行的，且同時存在同化還原和異化還原，這與酵母類似。在酵母菌中，在低濃度的硒酸鹽下，并不還原產(chǎn)生納米硒，而是產(chǎn)生負二價硒（Se2-），負二價硒（Se2-）不穩(wěn)定，容易與蛋白或多糖結(jié)合，由此生成硒蛋白或硒多糖。在較高硒酸鹽濃度下，酵母菌除產(chǎn)生負二價硒（Se2-）外，還會在細胞周質(zhì)空間還原產(chǎn)生一定量的納米硒[34]。

圖3 微生物還原硒酸鹽生成納米硒的機制Fig.3 Formation mechanism of nano-selenium by microorganism reduction selenate

由硒酸鹽還原成亞硒酸鹽的機制已研究的較為透徹，但由亞硒酸鹽還原成納米硒單質(zhì)的分子機制還未完全闡明，但目前根據(jù)先前的研究，有人提出了亞硒酸鹽還原為硒單質(zhì)的5種不同機制的假設(shè)[35]，見圖4。大部分研究認為，硫酸鹽途徑中的亞硫酸鹽還原酶、硝酸鹽途徑中的亞硝酸鹽還原酶和谷胱甘肽還原酶系統(tǒng)是主要的亞硒酸鹽還原酶系統(tǒng)，但不同細菌對亞硒酸鹽的代謝途徑并不同，可能由單一途徑或多個途徑共同參與亞硒酸的還原。如在莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulate）中，低濃度的亞硝酸鹽會抑制亞硒酸鹽的還原，說明亞硒酸鹽是通過硝酸鹽代謝途徑進行還原的；在叢毛單胞菌（Comamonassp.）中，添加低濃度的硫酸鹽會抑制納米硒的生成，說明亞硒酸鹽是通過硫酸鹽代謝途徑進行還原的；而在深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）中，可能是多個途徑參與了亞硒酸鹽的還原[36-37]。

圖4 亞硒酸鹽在微生物中的還原機制Fig.4 Reduction mechanism of selenite in microorganisms

4 微生物納米硒的應(yīng)用前景

4.1 微生物納米硒在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

4.1.1 納米硒的抗氧化性能

納米硒進入生物體內(nèi)后可以通過增強體內(nèi)抗氧化防御體系中的關(guān)鍵抗氧化酶活性來提高機體的抗氧化性能和有效清除自由基的能力。BAI K等[38]通過給小鼠口服殼聚糖包裹的納米硒發(fā)現(xiàn)，納米硒可以顯著增強體內(nèi)血清和肝臟中的谷胱甘肽過氧化氫酶（glutathione peroxidase，GPx）活性，同時還能增強超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，抑制脂質(zhì)過氧化，減少紫外線對小鼠的損傷。還有研究報道，進入體內(nèi)的納米硒可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，防止蛋白發(fā)生糖基化修飾，從而抑制了活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生[39]。

4.1.2 納米硒的抗腫瘤性能

已有大量研究表明，缺硒與多種癌癥的發(fā)生都有一定的關(guān)系，缺硒可能會增加癌癥的發(fā)生率。KONG L等[40]證實了納米硒能夠通過蛋白激酶B/小鼠雙微體2/雄激素受體（protein kinase B/mouse double minute 2/androgen receptor，PKB/Mdm2/AR）介導(dǎo)的信號通路引起腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的繼續(xù)增殖。基于此，研究人員通過在納米硒表面添加不同的修飾基團，提高納米硒的誘導(dǎo)性和靶向性，研發(fā)一些相關(guān)的納米硒抗癌藥物。ZHANG Y等[41]利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）在納米硒的表面進行修飾，最終獲得了新型的抗癌藥物SeNPs@ATP，使用該藥物后，主要出現(xiàn)了sub-G1細胞群大量累積、磷脂酰絲氨酸暴露、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）斷裂、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（polyadenosine diphosphate-ribose polymerase，PARP）以及天冬氨酸激酶被激活等現(xiàn)象，說明SeNPs@ATP確實能夠誘導(dǎo)癌細胞的凋亡；FENG Y等[42]分別利用不同性質(zhì)的氨基酸對納米硒進行修飾，通過人體乳腺癌細胞模型發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過氨基酸修飾的納米硒均能有效抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖，其中經(jīng)賴氨酸修飾的納米硒顆粒Lys-SeNPs效果最好。也有研究發(fā)現(xiàn)，利用生物多糖修飾的納米硒能夠有效抑制膠質(zhì)瘤細胞[43]。

另外，以納米硒作為載體負載抗腫瘤藥物也是納米硒抗癌藥物研發(fā)的一種策略。國內(nèi)已經(jīng)對RDG肽（由精氨酸Arg、甘氨酸Gly和天冬氨酸Asp所組成的短肽）、阿霉素、葉酸等與納米硒負載，取得了良好的效果[44-45]。另有研究報道，納米硒的攝入提高了癌細胞對順鉑藥物的敏感性，從而降低癌細胞的耐藥性[46]。

4.1.3 納米硒的免疫學(xué)效應(yīng)

硒能通過促進T淋巴細胞、B淋巴細胞、吞噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞的增殖分化來提高動物的免疫力。有研究表明，在肉雞飼養(yǎng)中，納米硒添加量達到0.3 mg/kg時，肉雞的免疫功能器官指數(shù)顯著增加[47]；在仔豬日糧中添加0.4～1.0 mg/kg的納米硒，能夠顯著提高血清中巨噬細胞的數(shù)量、抗體細胞的生成數(shù)、NK細胞的數(shù)量及免疫球蛋白的數(shù)量，且納米硒添加組的作用效果高于亞硒酸鈉和硒代蛋氨酸添加組[48]。

4.2 微生物納米硒在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

農(nóng)產(chǎn)品中的硒主要來源于土壤，而我國大部分地區(qū)都屬于缺硒的土壤，微生物納米硒可以用于缺硒地區(qū)土壤的補硒和富硒農(nóng)作物的栽培，不但能夠使作物富硒，而且能夠提高作物的生長性能、抗氧化等抗逆性能，保護作物減少病原菌等的入侵。董雍等[49]利用紅色納米硒對水稻和柑橘進行噴灑，生產(chǎn)出了符合標準的安全、有效的富硒大米和富硒柑橘；胡萬行等[50]利用納米硒營養(yǎng)液對馬鈴薯進行葉面噴施，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米硒能顯著促進紫色馬鈴薯的光合作用和生長發(fā)育；白婭男等[51]將納米硒制成了一種含硒葉面肥，對甘蔗進行葉面噴施，為富硒甘蔗蔗筍的生產(chǎn)提供了一種有效的富硒途徑；李利軍等[52]在獼猴桃栽培過程中噴施納米硒微生物菌肥，有效提高了獼猴桃的硒含量，改善了獼猴桃的風(fēng)味品質(zhì)。

4.3 微生物納米硒在動物飼養(yǎng)中的應(yīng)用

硒是哺乳動物中不可缺少的微量元素之一。飼養(yǎng)動物對硒元素的獲得主要靠飼料攝取，納米硒的毒性低、吸收好，應(yīng)用性能要好于其他形態(tài)硒。適量的硒元素不僅可以提高畜禽動物的生長性能、免疫力、繁殖性能，還能夠改善動物的肉品質(zhì)[53]。申惠敏等[54]以公豬為研究對象，將納米硒添加到日糧中，可提高公豬的精子活力，同時受精率也相應(yīng)提高，說明納米硒是一種非常有價值的飼料添加劑。

5 結(jié)論與展望

微生物納米硒是一種最具應(yīng)用前景的硒形態(tài)，本文從宏觀上對微生物納米硒的微生物種類、轉(zhuǎn)化機制及應(yīng)用進行了綜述，對微生物轉(zhuǎn)化納米硒有了一個全面的認識。但硒元素的作用機制及其在可持續(xù)發(fā)展中的應(yīng)用仍需進一步探討。另外，微生物納米硒還有一些問題有待解決，包括硒和納米硒在不同環(huán)境下對陸地生物的作用效果以及無機硒、有機硒和納米硒對土壤微生物活性的影響。