郭 珊，易世杰，陽學風，曹 婷，傅 念，周克兵，龍建武

南華大學附屬南華醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421002

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精以及其他明確損肝病因引起的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過多的沉積為主要表現(xiàn)的世界最常見的肝疾病[1]。環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)是一種誘導(dǎo)型酶，曹名波等[2]研究表明，COX-2能夠誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進而引起NAFLD，同時能夠加重肝細胞的凋亡；應(yīng)用COX-2抑制劑，使COX-2表達下調(diào)，進而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕脂肪肝的肝組織損傷。因此，COX-2對NAFLD有調(diào)控作用。有研究[3-8]表明，長鏈脂酰輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetases，Acsl)是?；せ蠲讣易宄蓡T之一，其催化合成脂酰CoA，為哺乳動物利用脂肪酸合成各類脂質(zhì)。在胚胎發(fā)育時期，腸道和肝組織是內(nèi)在相互聯(lián)系的。研究[9]表明，腸道和肝之間存在多層次的相互依賴關(guān)系，腸-肝軸紊亂與一系列肥胖相關(guān)疾病密切相關(guān)，NAFLD 患者腸道通透性較正常人明顯增高。脂肪的吸收主要在小腸，小腸豐富表達Acsl基因。因此本實驗旨在探討COX-2抑制劑對NAFLD大鼠回腸Acsl基因家族表達的影響，進而明確COX-2是否能夠通過調(diào)節(jié)回腸Acsl的表達從而影響NAFLD的發(fā)展，為NAFLD的發(fā)病機制和治療新靶點的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 45只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自于上海西普爾-必凱實驗動物機構(gòu)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0016;實驗動物使用許可證編號：SYXK(湘)2020-0002]。高脂飼料：80.5%基礎(chǔ)飼料，10%蛋黃粉，7%豬油，2%膽固醇，0.5%膽鹽(南通特洛菲飼料科技有限公司)。高脂飼料購于杭州赫貝公司。伊紅、蘇木精、油紅O染液購自美國SIGMA公司，高純總RNA快速提取試劑盒購自中國上海Generay公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物飼養(yǎng)、分組及給藥 45只SD雄性大鼠均在南華大學實驗動物研究中心飼養(yǎng)，所有SD大鼠的飼料量全部以1015 g·100 g-1·d-1的標準進行喂養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將所有SD大鼠根據(jù)完全隨機法分為3組，分別為：正常對照組(n=15只,普通飼料)；NAFLD模型組(n=15,高脂飼料)；尼美舒利組(n=15,高脂喂養(yǎng)8周后，予以尼美舒利6 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)4周)。SD大鼠全部按照之前的標準飼養(yǎng)，飼養(yǎng)到第12周處死。

1.2.2 實驗觀察和大鼠管理 飼養(yǎng)大鼠過程中觀察各組大鼠的毛發(fā)、精神、營養(yǎng)狀態(tài)、行為和食欲，嚴格按照相關(guān)規(guī)定處理及飼養(yǎng)所有大鼠。實驗期間所用的籠具必須定期消毒、清洗，同時需要及時整理衛(wèi)生、更換墊料、消毒喂養(yǎng)室，飼料必須經(jīng)高壓消毒后放到清潔準備間儲存，儲存時間不得超過15 d，保持飼養(yǎng)環(huán)境能夠長期達標。

1.2.3 各組靜脈血清學數(shù)據(jù)的測定 大鼠深度麻醉后，采取各組大鼠下腔靜脈血，以3000 r/min，離心10 min，分離血清后迅速送到南華大學附屬南華醫(yī)院檢驗科，全自動生化分析儀檢測各組大鼠靜脈血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的數(shù)值。

1.2.4 肝組織病理學檢查 4%多聚甲醛浸泡固定肝組織后，進行石蠟包埋切片，行HE染色。用4%多聚甲醛固定肝組織2～4 h后，包埋在OCT冰凍切片中，行肝臟油紅O染色。該步驟在南華大學病理學教研室完成，需在普通光鏡下觀察切片情況并顯微照相記錄。

1.2.5 引物設(shè)計 Acsl1上游引物為5′-TGTGGTTCCGAGACTGCTA-3′，下游引物為5′-AGGCTGTTGTTTCTGACGAT-3′，片段長度為141 bp；Acsl3上游引物為5′-GGCTGAGTGGATGATTGCTG-3′，下游引物為5′-GGCTGAGTGGATGATTGCTG-3′，片段長度為128 bp；Acsl4上游引物為5′-TGGCTACTTACCTTTGGCTCAT-3′，下游引物為5′- TCACCCTTGCTTCCCTTCT-3′，片段長度為138 bp；Acsl5上游引物為5′-AACCAGTCTGTAGGGATTGAGG-3′，下游引物為5′- GGCGTCTGAGAAGTAATAAAGGAT-3′，片段長度為87 bp；Acsl6上游引物為5′-CAGTTGCTTACCCACTACTATGACG-3′，下游引物為5′-CCACCTCTTGATAGGACAGCC-3′，片段長度為87 bp；COX-2上游引物為5′-TCAGCCATGCAGCAAATCCTT-3′，下游引物為5′ -CCGTAGAATCCAGTCCGGGT-3′，片段長度為112 bp。

1.2.6 qPCR 檢測回腸Acsl的表達 Trizol-離心柱法提取總RNA，測定 RNA純度和RNA定量，取總RNA 2 μg在逆轉(zhuǎn)錄作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，按以下程序進行PCR反應(yīng)擴增:50 ℃ 3 min，95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，35循環(huán)。qPCR結(jié)束后，制作溶解曲線，反應(yīng)條件為72 °C 20 s，從70 ℃開始到95 °C，每增加0.5 ℃，保持5 s，讀取吸光值。取5 μl擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，實驗結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager自動統(tǒng)計和計算，最后依照實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，并根據(jù)2-ΔΔCt值繪制各樣品目的基因的相對定量直方圖。

1.3 倫理學審查 本研究方案經(jīng)由南華大學附屬南華醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批(批號：20201938)，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 飼養(yǎng)大鼠過程中，觀察到對照組大鼠毛發(fā)光澤，營養(yǎng)狀態(tài)良好，反應(yīng)迅速，食欲佳，無攻擊性。而NAFLD模型組的大鼠毛發(fā)逐漸失去光澤，營養(yǎng)狀態(tài)欠佳，反應(yīng)遲鈍，食欲欠佳，個別有攻擊性。與NAFLD模型組大鼠比較，尼美舒利組的大鼠的毛發(fā)色澤、營養(yǎng)狀態(tài)、反應(yīng)以及食欲均有明顯改善。正常對照組、NAFLD模型組、尼美舒利組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照各組喂養(yǎng)方式至12周。喂養(yǎng)0、4、8、12 周時正常對照組小鼠體質(zhì)量分別為：(20.81±1.95)g、(24.65±3.86)g、(26.52±2.89)g、(28.47±3.18)g；NAFLD模型組小鼠的體質(zhì)量分別為：(21.18±2.38)g、(26.21±3.45)g、(30.86±3.62)g、(32.78±3.77)g；尼美舒利組小鼠的體質(zhì)量分別為：(21.96±3.06)g、(25.39±2.42)g、(30.53±2.88)g、(24.78±3.66)g。

2.2 各組大鼠TG、TC的比較 與對照組大鼠相比，NAFLD模型組大鼠血清TG、TC值均增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。而與NAFLD模型組相比，尼美舒利組大鼠血清TG、TC值均下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清TG、TC結(jié)果(mmol/L)

2.3 肝臟HE染色分析及鏡下診斷 正常對照組：肝細胞排列規(guī)則，肝細胞核大小形態(tài)正常。肝組織、肝小葉結(jié)構(gòu)完整無破損，未見炎癥細胞浸潤、肝脂肪變性、纖維間隔形成(圖1)。NAFLD模型組：肝細胞排列不規(guī)則，中央靜脈缺如，可見各細胞變大變圓，細胞氣球樣改變，大量不同大小的脂肪滴。肝組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，可見纖維間隔、假小葉、大量壞死及炎癥細胞浸潤、明顯肝脂肪變性(圖2)。尼美舒利組：肝細胞排列尚規(guī)則，細胞輕度腫脹，可見數(shù)個直徑較小的脂滴，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，未見假小葉和纖維間隔(圖3)。

2.4 肝臟油紅O染色分析及鏡下診斷 正常對照組：細胞邊界清晰，細胞質(zhì)豐富不顯色，細胞核膜完整無破壞，細胞核為深藍色，無紅色脂滴(圖4a)。NAFLD模型組：細胞邊界模糊，整個視野可見脂肪顆粒，表現(xiàn)為大小不等的紅色斑點，期間可見散在深藍色的細胞核(圖4b)。尼美舒利組：細胞邊界尚完整，整個視野可見少量紅色脂肪顆粒，紅色顆粒與NAFLD模型組比較明顯減少，可見少許散在深藍細胞核(圖4c)。

2.5 qPCR法檢測回腸COX-2及Acsl家族基因的基因表達情況 與正常對照組大鼠相比，NAFLD模型組大鼠回腸COX-2的表達明顯升高(P<0.05)；與NAFLD模型組大鼠相比，尼美舒利組回腸COX-2的表達明顯降低(P<0.05)。與正常對照組相比，NAFLD模型組回腸Acsl3、Acsl5基因的表達明顯增加(P值均<0.05)；與NAFLD模型組相比，尼美舒利組Acsl3、Acsl5基因的表達明顯降低(P值均<0.05)(表2)。

3 討論

NAFLD主要由肥胖、胰島素抵抗、遺傳易感性和線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致[10]。早期NAFLD患者無明顯臨床癥狀[11]。在NAFLD 病情發(fā)展中，脂肪堆積過多，肝細胞發(fā)生變性、壞死，最終可形成肝纖維化，導(dǎo)致肝硬化[12-13]。NAFLD也是西方國家最常見的慢性肝病病因，預(yù)計到2030年NAFLD將成為肝移植最常見的適應(yīng)證[14]。NAFLD 主要發(fā)生于肥胖人群，與代謝綜合征及糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著生活質(zhì)量的不斷提高，發(fā)病率逐年上升，嚴重危害人類健康，治療和預(yù)防越來越引起人們的重視。NAFLD 發(fā)病機制十分復(fù)雜，尚未完全明確，近年來對發(fā)病機制的認識由“二次打擊學說”逐漸向“多重打擊模型”轉(zhuǎn)變[15]。目前，許多研究多集中在闡明NAFLD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素，這些相關(guān)因素被稱為“多重平行打擊”，它們能夠促使肝脂肪變向更復(fù)雜更嚴重的NAFLD病程進展[16]。這些相關(guān)因素包括：腸道菌群失調(diào)[17]、飲食結(jié)構(gòu)改變[18]、腸道通透性變化[19]、相關(guān)基因改變[20]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[21]以及相關(guān)信號通路活化等[22]。

表2 各組回腸中COX-2、Acsl1、Acsl3、Acsl4、Acsl5、Acsl6基因的表達水平

COX-2是一種誘導(dǎo)型酶，正常情況下，大部分組織不表達COX-2，只有在各種炎癥因子及癌基因等刺激下才會表達。脂質(zhì)在回腸消化吸收過多引起脂肪代謝紊亂，誘導(dǎo)毒性脂代謝產(chǎn)物沉積與活性氧化物質(zhì)生成過多，引起炎癥反應(yīng)，從而使COX-2表達增加。同時，COX-2能夠加重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)肝細胞的凋亡從而引起NAFLD。應(yīng)用COX-2抑制劑，可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進而緩解脂肪肝的脂肪變性和肝細胞損傷[23]。有研究[24]表明，小腸黏膜受損狀況下，COX-2的表達增加，且與炎癥程度呈正相關(guān)。同時有實驗[25]發(fā)現(xiàn)，炎癥小腸上皮COX-2水平較正常小腸上皮明顯增加，而經(jīng)槲皮素處理后小腸黏膜損傷情況好轉(zhuǎn)，其COX-2表達明顯降低。本研究結(jié)果表明：與正常對照組比較，NAFLD模型組回腸COX-2表達明顯升高，與NAFLD模型組比較，尼美舒利組大鼠回腸上COX-2表達明顯降低。NAFLD的回腸COX-2呈高表達，說明COX-2參與回腸脂質(zhì)反應(yīng)，應(yīng)用COX-2抑制劑尼美舒利后，可以改善肝組織損傷、減輕肝脂肪變性。

Acsl家族基因有5個亞型，分別為Acsl1、Acsl3、Acsl4、Acsl5、Acsl6，這5種基因在組織特異性以及底物特異性上都存在一定區(qū)別，但都具有相同的催化作用：催化游離脂肪酸合成脂酰CoA[26]，參與TG的合成。Acsl3作為長鏈脂酰CoA合成酶家族中的一員，主要生理功能是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝，催化長鏈脂肪酸激活的第一步，參與脂質(zhì)合成和蛋白質(zhì)修飾。有研究[27]發(fā)現(xiàn)，Acsl3在高脂飼養(yǎng)大鼠模型肝組織中呈高表達，且血中TG、游離脂肪酸明顯升高；抑制Acsl3表達后，脂酰CoA合成酶活性降低，最終使肝臟脂質(zhì)沉積減少，說明下調(diào)Acsl3的表達可以改善肝纖維化。Bauer等[28]研究證實，通過下調(diào)小腸上依賴Acsl3誘導(dǎo)的脂質(zhì)合成，加氏乳桿菌能夠減少腸道脂質(zhì)代謝，改變腸道內(nèi)環(huán)境，說明抑制小腸Acsl3可以減少脂質(zhì)合成。Acsl5作為長鏈脂酰CoA合成酶家族中的一員，豐富表達于小腸，參與脂質(zhì)合成和分解代謝。Reinartz等[29]研究證實，脂肪肝的大鼠可上調(diào)Acsl5的表達，脂肪酸的攝取增多，TG合成增加，抑制肝細胞增殖，促進肝細胞凋亡。有研究[29]表明，棕櫚酸或油酸能夠使肝星狀細胞中Acsl1、Acsl5、Acsl6的表達上調(diào)，而應(yīng)用COX-2后能拮抗棕櫚酸或油酸誘導(dǎo)的Acsl5、Acsl6表達上調(diào)，從而抑制肝星狀細胞脂化，促進其活化而引起肝纖維化。

小腸是脂質(zhì)吸收的重要場所，本研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在NAFLD大鼠回腸末端高表達，其可能通過促進回腸過多的脂質(zhì)消化吸收引起脂肪代謝紊亂。COX-2有調(diào)控Acsl家族某些基因的作用。本課題組前期實驗[8]已證明，COX-2能通過調(diào)節(jié)肝星狀細胞上Acsl1、Acsl4、Acsl6的表達，從而改變肝星狀細胞的活性，參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。同時有研究[30]表明，尼美舒利對COX-2的抑制作用抑制了肝臟炎癥和纖維化發(fā)生，并降低了NAFLD的胰島素抵抗。本實驗通過qPCR法檢測回腸Acsl3及Acsl5的表達情況，結(jié)果表明，NAFLD模型組與正常對照組相比，回腸Acsl3、Acsl5的表達顯著增加，而與NAFLD模型組相比，尼美舒利組回腸Acsl3、Acsl5的表達顯著下降。因此推斷：Acsl3、Acsl5參與回腸脂質(zhì)代謝，COX-2在回腸末端可能通過啟動Acsl3及Acsl5參與脂質(zhì)合成的作用，從而參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展，COX-2抑制劑尼美舒利可能通過下調(diào)回腸Acsl3、Acsl5的表達，改善脂肪肝大鼠的肝臟脂肪變和纖維化，但其中具體機制還需組進一步研究。

本實驗結(jié)果同時顯示，NAFLD模型組與正常對照組相比，Acsl1、Acsl4、Acsl6表達均無明顯變化，尼美舒利組與NAFLD模型組相比，Acsl1、Acsl4、Acsl 6的表達均無明顯變化，因此可知，Acsl1、Acsl4、Acsl6在脂肪肝小鼠和正常小鼠的回腸上表達無明顯變化，回腸上Acsl1、Acsl4、Acsl6可能不參與NAFLD的過程，Acsl1、Acsl4、Acsl6可能通過其他途徑參與NAFLD的進展。

本實驗表明，尼美舒利可以下調(diào)脂肪肝大鼠回腸Acsl3、Acsl5的表達，其具體作用機制尚待進一步研究證實。更深入地研究COX-2抑制劑與回腸Acsl3、Acsl5的功能及其調(diào)控關(guān)系，可對探索NAFLD治療靶點提供新的途徑。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：郭珊、易世杰、曹婷、陽學風負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；郭珊、傅念、周克兵、龍建武參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；陽學風負責擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。